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相似文献
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1.
李鹤宾  洪璇  黄秀梅 《台湾海峡》2012,31(3):375-379
将嗜热菌Geobacillus sp. ZH1的超氧化物歧化酶(supseroxide dismutase,SOD)基因插入表达载体pET-32α(+),在Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达,并利用亲和层析纯化重组超氧化物歧化酶.将制备的脱辅SOD进行Mn2+和Fe2+金属重构后,得到的Mn2+重构SOD的比活力达668U/mg,Fe2+重构Fe-SOD没有活性,说明ZH1菌株的超氧化物歧化酶为Mn-SOD.凝胶过滤及SDS-PAGE分析显示,Mn2+重构SOD为同聚二聚体,亚基分子量为71.7 kDa.这些研究结果为进一步研究该酶的生化特性及酶的定向进化研究奠定了良好的基础.  相似文献   

2.
李鹤宾  王怡倩 《台湾海峡》2007,26(4):543-547
从厦门近海温泉中分离并鉴定了一株嗜热嗜热菌(Thermus thermophiluswl).将从基因组中克隆到的超氧化物歧化酶(supseroxide dismutase,SOD)基因插入pGEX-4T-2表达载体,在E.coliDH5α中成功表达了谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-trans-ferase,GST)融合的目的蛋白.重组SOD酶的比活性达580.3U/mg.体外表达纯化的GST-SOD蛋白免疫小鼠,制备SOD特异性抗体.Western blot结果显示,鼠抗GST-SOD抗体能特异性地与T.thermophiluswl的细胞裂解液中一分子量为27 kDa的蛋白反应,与该基因ORF预期大小接近.以上研究为进一步研究该酶的生理生化特性奠定了基础.  相似文献   

3.
芳香化酶Cyp19a在鱼类性别决定和性别分化中起关键作用,通过调控体内雌、雄激素的转化来影响鱼类性别表型形成。为深入研究Cyp19a在牙鲆(Paralichthys olivaceus)性腺分化和发育过程中的表达规律及作用机制,本文从牙鲆cDNA中克隆获得1557bp的cyp19a基因编码序列,并成功构建了原核重组表达质粒。经体外重组与纯化获得较高纯度的重组Cyp19a蛋白;以此作为抗原免疫兔子,制备多克隆抗体。用间接酶联免疫吸附剂测定(ELISA)技术检测抗血清效价,评估其免疫原性。结果表明免疫结束后得到的抗体血清效价超过了1∶50000,且纯化后抗体具有较好活性。Western Blot(WB)检测结果表明Cyp19a兔多抗可以特异性识别牙鲆重组Cyp19a蛋白和内源性Cyp19a蛋白。蛋白水平的雌雄性腺差异表达分析显示,牙鲆Cyp19a蛋白在卵巢中高表达,在精巢中微量表达。利用Foxl2和Dmrt1重组蛋白处理牙鲆性腺分化期幼鱼可分别显著上调和下调Cyp19a的表达(P<0.05)。综上所述,本研究成功制备了牙鲆Cyp19a多克隆抗体并进行了应用,为深入研究牙鲆等鱼类性别分化机制提供有力工具。  相似文献   

4.
为了探究灿烂弧菌中 Zn2+转运系统的细胞周质组分 VsA 的表达与功能,本实验采用 PCR 克隆 vsA 基因,实时荧光定量测定 vsA 基因的表达,利用抗体封闭实验研究 VsA 蛋白的功能。生物信息学分析表明 VsA 具有结合和转运 Zn2+的结构基础。实时荧光定量结果表明,vsA 的表达受 Zn2+调控,且具有浓度依赖性,0.01 mmol/L 的 Zn2+可使 vsA 的表达量下调至对照组的0.5倍,而添加等摩尔量的 Cu2+、Fe3+、Mg2+和 Ca2+对 vsA 的表达无明显影响。而 0.1 滋mol/L Zn2+则会诱导 vsA 的表达。此外,在大肠杆菌 Escherichia coli BL21 (DE3) 中进行了 VsA 的重组表达,制备了 VsA 的小鼠多克隆抗体。利用抗体封闭 VsA 蛋白可导致灿烂弧菌在 Zn2+限制条件下的生长受抑制,以及过氧化氢的能力和粘附效率的降低。本研究获得了灿烂弧菌的 vsA 基因,其表达受 Zn2+浓度调控,VsA 蛋白在灿烂弧菌生长、抗氧化以及粘附宿主细胞过程中发挥作用。  相似文献   

5.
神经肽Y(Neuropeptide Y,NPY)被普遍认为是一种重要的促食因子,在调节鱼类的摄食行为方面起着至关重要的作用。为进一步研究牙鲆NPY蛋白的生物学功能,作者克隆了牙鲆NPY成熟肽序列(m-NPY)及含有信号肽的全长序列(f-NPY),利用原核表达系统分别进行体外重组表达,筛选出诱导剂IPTG最佳诱导浓度为0.8 mmol/L及最佳诱导时间3 h;此外,根据牙鲆NPY第49-64位氨基酸序列制备了多克隆抗体并通过Western blot验证该多抗能够有效检验重组NPY及牙鲆体内NPY的表达。研究结果为研究重组牙鲆NPY蛋白在牙鲆水产养殖产业中的应用及检测提供了依据。  相似文献   

6.
将青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)肌球蛋白重链基因片段亚克隆到pET-30a质粒,构建出重组表达载体并转化入大肠杆菌Escherichia coli BL21中.经SDS-PAGE和Western杂交检测表明,在IPTG诱导下含有重组载体的菌株可表达分子质量约30 ku的融合蛋白.诱导条件优化实验结果显示,该菌株经0.2 mmol/L IPTG诱导1 h就可大量表达此蛋白.可溶性实验确认该重组蛋白是可溶性蛋白.本研究为文昌鱼肌球蛋白重链特异性抗体的制备奠定了基础.  相似文献   

7.
肌肉生长抑制素抑制动物肌肉的生长发育.根据本实验室克隆的大黄鱼(Pseudosciaena cro-cea)肌肉生长抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物,用RT-PCR扩增目的片段,构建MSTN-pET-28 a重组表达质粒,将其转化到大肠杆菌BL21上并用1.0 mmol/dm3IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测该目的蛋白大小约为44 kDa,与理论值大小符合.用0.25 mol/dm3KCl染色后从凝胶中切取该蛋白且回收.该回收蛋白与弗氏佐剂等量混合后注射ICR小鼠制备多克隆抗体,并用Westernblot检测该抗体.免疫印迹结果在44 kDa的位置上出现棕色条带,表明大黄鱼肌肉生长抑制素的多克隆抗体制备成功.这为今后对肌肉生长抑制素功能的研究奠定了基础.  相似文献   

8.
硫醌氧化还原酶(Sulfide:quinone oxidoreductase,SQR),是线粒体硫化物代谢的关键酶。本研究以生活在潮间带下区及潮下带中的底栖生物—单环刺螠SQR重组蛋白为材料,建立了单环刺螠SQR间接竞争ELISA检测方法,为定量分析SQR蛋白水平表达奠定了基础。将SQR重组蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,检测效价高达1:64 000。采用免疫印迹实验,将该抗体与重组蛋白和体壁总蛋白杂交,均得到了单一的条带,表明该抗体特异性好。优化SQR间接竞争ELISA检测条件,得出最佳的抗原包被浓度为250ng/mL,一抗浓度为1∶20 000,二抗浓度为1∶12 000,此条件下建立的标准曲线检测范围为2.5~1 000ng/mL。精确度检测结果显示,批内差异在0.42%~7.27%、批间差异在2.58%~7.78%范围内,表明该条件下精确度具有良好的准确性和重复性。以上结果表明,已成功建立单环刺螠SQR间接竞争ELISA检测方法。  相似文献   

9.
岳明  丁宏标  乔宇 《海洋学报》2007,29(5):154-160
褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)是一种海藻酸降解菌.本实验采用PCR的方法,以褐球固氮菌基因组DNA为模板,克隆出约1.05 kb的海藻酸裂解酶基因algL的成熟蛋白编码序列,并将其插入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K-algL.重组质粒线性化后用聚乙二醇(PEG)法导入毕赤酵母菌株GS115中,获得高效分泌表达海藻酸裂解酶的毕赤酵母工程菌株.用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,表达得到43 kDa的目的蛋白,酶活力可达1 400 U/cm3左右.经测定,该重组酶的最适反应pH为8.5,最适反应温度为40℃,并且在20~55℃,pH2.0~11.0具有较好的稳定性.另外,10 mmol/cm3的Cu2+,Fe2+,Co2+,Mn2+和Ca2+对酶有不同程度的抑制作用.  相似文献   

10.
嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)wl的超氧化物歧化酶基因在Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达,采用Ni-NTA agarose亲和层析获得重组超氧化物歧化酶,比活力达565 U/mg.重组酶的相对分子质量为110.9 kDa,亚基相对分子质量为28.3 kDa,该酶为同聚四聚体蛋白.重组酶对氯仿-乙醇和SDS敏感,对H2O2不敏感,并且它的紫外最大吸收波长位于279 nm,判断其属于锰超氧化物歧化酶类型.1.0 mmol/dm3Mn2+对重组酶有激活作用,同浓度的其他金属离子Mg2+、Ca2+、Ba2+、Co2+、Cu2+、Zn2+和Fe2+对重组酶活力都有抑制作用,其中以Co2+的作用最强,抑制了约64%的酶活性.重组酶在70℃下处理1 h,保持原有活力的60%,即使在90℃下处理1 h,仍保持原有活力的35%.在pH值为4.0~11.0的缓冲液中25℃下处理1 h,保持65%以上的原始活力.由此可见,重组锰超氧化物歧化酶具有高的热稳定性和宽pH稳定性,在工业上具有巨大的应用潜力.  相似文献   

11.
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对广西英罗港内滩和中滩红树林中的白骨壤Avicennia marina、桐花树Ae-giceras corniculatum和秋茄Kandelia candel叶片的过氧化物酶(POD)同工酶、超氧化物歧化酶(SOD)同工酶进行了电泳分离及酶活力测定,同时测定了红树植物采样点土壤的Mn、Cr、Cd、Pb、Cu和Zn 6种重金属元素的含量。结果表明:(1)内滩的3种红树植物叶片的POD同工酶的带数或酶活力均大于中滩;桐花树和秋茄SOD同工酶的变化趋势与POD相似,但酶活力变化幅度小于POD。(2)土壤中各种重金属含量的大小顺序是Mn>Cr>Zn>Pb>Cu>Cd,中滩高于内滩。(3)桐花树POD同工酶活力变化可对土壤重金属污染起指示作用。  相似文献   

12.
于1997年10月-1998年1月,从胶州湾贝类养殖场购买栉孔扇贝,分别采用邻苯三酚自氧化法和过氧化氢法测定了其血细胞和血清中的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活力,并对SOD类型的鉴别区分、SOD和CAT的热稳定性以及温度对SOD和CAT活力的影响进行研究。结果表明,血细胞中SOD和 CAT活力分别为312.7U和 124.4U,血清中SOD和CAT活力分别为102.3U和73.8U;冻存10d后,血清中SOD的活力丧失24.6%,而CAT的活力丧失40.8%;血细胞中CuZn-SOD和Mn-SOD的活力分别为193.4U和82.3U,血清中仅存在CuZn-SOD活性;血清中SOD的热稳定性很高,在80℃下保温30min后,酶活力仍很高,而CAT的热稳定性较低;血清中的SOD和CAT的最适温度分别为50℃和45℃。  相似文献   

13.
A thermostable superoxide dismutase (SOD) from the inshore thermophile Thermus sp. JM1 was purified to homogeneity by steps of fractional ammonium sulfate precipitation, DEAE-Sepharose chromatography and Phenyl-Sepharose chromatography. The specific activity of the purified native enzyme was 1 656 U/mg. A sod gene from this strain was cloned and overexpressed in Escherichia coli (E. coli). The prepared apo-enzyme of the purified recombinant SOD (rSOD) was reconstituted with either Fe or Mn by means of incubation with appropriate metal salts. As a result, only Mn 2+ - reconstituted rSOD (Mn-rSOD) exhibited the specific activity of 1 598 U/mg. SOD from Thermus sp. JM1 was Mn-SOD, judging by the specific activities analysis of Fe or Mn reconstituted rSODs and the insensitivity of the native SOD to both cyanide and H 2 O 2 . Both the native SOD and Mn- rSOD were determined to be homotetramers with monomeric molecular mass of 26 kDa and 27.5 kDa, respectively. They had high thermostability at 50 ° C and 60 ° C, and showed striking stability across a wide pH span from 4.0 to 11.0.  相似文献   

14.
镉对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)抗氧化酶活性的影响   总被引:6,自引:0,他引:6  
将中华绒螯蟹(河蟹Eriocheir sinensis)浸泡在2.Omg/L氯化镉(CdCl2)溶液中,分别于第0、6、12、24、48、72、96小时提取河蟹的肝胰腺,测定抗氧化酶:超氧化物歧化酶(Superoxicle dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxiclase.GPx)的活性,探讨了镉(Cd^2 )对河蟹肝胰腺抗氧化酶活性的影响。结果显示,在低浓度Cd^2 环境下,河蟹肝胰腺的抗氧化酶活性随时间发生规律性变化。暴露于Cd^2 后,河蟹肝胰脏SOD活性降低,随时间的延长,在暴露72h后,SOD活性恢复并超过未染毒时22.3%。表明Cd^2 中毒导致细胞内氧自由基大量积累从而诱导酶活性升高;CAT活性先下降后增高,随后减少,最后以低于对照的水平趋于平衡;肝胰腺中GPx酶活性的变化规律与SOD相似,在解除氧自由基毒性方面有一定的协调性。实验表明河蟹抗氧化系统酶对Cd^2 很敏感。而酶活性在短时间内的变化规律可以为镉对河蟹早期的毒性研究提供参考。  相似文献   

15.
栉孔扇贝不同组织SOD、CAT和MPO活力的比较分析   总被引:4,自引:0,他引:4  
对2龄和3龄栉孔扇贝外套膜、鳃、消化盲囊、肾、闭壳肌、性腺组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和髓过氧化物酶(MPO)活力分析表明,检测组织均存在这三种酶,且在不同组织中活力表现存在明显差别,其中肾组织SOD、CAT活力最高,而MPO在消化盲囊中表现最高活力,与其它组织相比均呈显著性差异(P<0.05).不同贝龄的栉孔扇贝酶活力比较表明,三龄贝各组织SOD、CAT和MPO活力均高于二龄贝.  相似文献   

16.
枝管藻多糖对久效磷暴露水体中鱼类保护作用的研究   总被引:3,自引:0,他引:3  
以金鱼(Carassius auratus)体内超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活力、乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesteras,AChE)活力变化为指标,观察了枝管藻多糖对久效磷暴露的水体中鱼类生理功能的影响。结果表明:用枝管藻多糖灌胃鲫鱼15d,枝管藻多糖能显著降低久效磷对鱼类体内SOD活力的诱导和有效阻止久效磷对鱼类中枢神经系统AChE活性的抑制,具有拮抗久效磷农药对鱼类毒害的作用。  相似文献   

17.
口虾蛄超氧化物歧化酶同工酶的组织特异性研究   总被引:8,自引:1,他引:7  
以口虾蛄为材料进行研究,用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,对其肌肉、心脏、腹鳃、肝胰腺及眼球5种组织器官进行超氧化物歧化酶(SOD)同工酶的研究分析。结果表明:不同组织中超氧化物歧化酶(SOD)的同工酶谱带存在差异,具有明显的组织特异性。眼球、腹鳃、肝胰腺和心脏中有2条酶带,肌肉中几乎不表达,心脏中SOD2和肝胰腺中SODl谱带表达最浓,而腹鳃中的酶带表达最弱。  相似文献   

18.
活性氧对3种海洋微藻生长的影响   总被引:6,自引:0,他引:6  
谢荣  唐学玺  李永祺  王悠 《海洋学报》2001,23(1):94-101
以Fe2+/Vc为活性氧诱生系统,对活性氧作用下3种海洋微藻的生长情况进行了研究.结果表明,低浓度的活性氧可以促进3种海洋微藻的生长,使藻细胞的脂质过氧化程度升高,同时刺激细胞的SOD活性使其略有上升,加入抗氧化剂可以抑制其促进作用;高浓度的活性氧能抑制3种海洋微藻细胞的生长,使细胞的脂质过氧化程度过量增高,抑制细胞的SOD活性,抗氧化剂可以缓解其对藻细胞的毒性作用.不同种类的微藻对活性氧的敏感性存在差异.  相似文献   

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