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1.
光学活性藻蓝蛋白β亚基的体内重组 总被引：1，自引：0，他引：1
在Synechococcus sp.PCC 7002中,首先发现了特异性催化脱辅基藻蓝蛋白β亚基(153位)与藻蓝胆素(phycocyanobiling, PCB)连接的裂合酶基因cpcT.本实验在Synechocystis sp.PCC 6803中找到与cpcT具有高度同源性的基因slr1649.构建2组相容的重组质粒pCDF-cpcB(C82I)或(C153I)-ho1-pcyA和pRSF-slr1649,cpcB(C82I)和cpcB(C153I)分别编码82和153位被突变的脱辅基藻蓝蛋白β亚基,slr1649编码可能的特异性裂合酶,在大肠杆菌体内生成PCB必需的2个基因(ho1编码血红素氧化酶,pcyA编码藻蓝胆素合成酶),将这些基因共同转化到大肠杆菌诱导表达,利用亲和层析柱对可溶性蛋白进行纯化,产物进行SDS-PAGE、色素蛋白锌电泳和光谱检测.结果表明基因slr1649能够特异性催化CpcB(153位)与PCB的连接,产生了具有光学活性的CpcB(C82I)-PCB,为进一步研究螺旋藻藻蓝蛋白的生物活性奠定了基础. 相似文献
2.
藻胆蛋白裂合酶是催化藻胆色素与脱辅基藻胆蛋白亚基共价连接的裂合酶,在藻胆蛋白的生物合成途径中发挥着重要作用。本实验以藻蓝蛋白裂合酶Cpc E/F为研究对象,采用基因工程组合表达技术,构建了pCDFDuet-apcA-cpcE/F-hox1-pebS、pCDFDuet-pecA-cpcE/F-hox1-pebS等重组质粒,并导入大肠杆菌中,在IPTG的诱导下,成功表达得到两种非天然藻胆蛋白ApcA-PEB和PecA-PEB,这表明Cpc E/F不仅可以催化藻蓝胆素和脱辅基藻蓝蛋白的结合,还可以催化藻红胆素(PEB)与别藻蓝蛋白α-亚基(ApcA)和藻红蓝蛋白α-亚基(PecA)的结合,因此是一种多功能的裂合酶。根据重组产物的光谱特征峰分析发现,ApcA-PEB和PecA-PEB作为两种非天然存在的重组藻胆蛋白,具有与对应天然藻胆蛋白有着相近的特征吸收光谱和荧光发射峰,但同时具有明显的波长偏移并伴有色素异化现象,其光谱学性质主要由其所携带的色素基团决定。另外,荧光寿命衰减分析发现,不同脱辅基蛋白对于重组藻胆蛋白的光谱稳定性具有重要的影响。 相似文献
3.
蓝隐藻藻蓝蛋白结构与功能稳定性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
以蓝隐藻(Chroomonas placiodea)藻蓝蛋白 PC-645为材料,通过改变环境 pH 和尿素质量浓度,监测其变性和复性过程中特征荧光谱和吸收谱的动力学变化,以期了解隐藻藻蓝蛋白的色基和蛋白结构稳定性及其与功能的关系。结果表明, PC-645在很宽的 pH 范围和一定质量浓度的尿素中维持结构和功能的稳定,空间结构具有很强的柔性。pH诱导的 PC-645蛋白构象与功能变化可分为3个不同的区段。(1)稳定区(pH 3.5~7)：吸收和荧光光谱都比较稳定,显示蛋白质构象和功能在此区域都保持正常。(2)次稳定区(pH 7~10)：光吸收依然保持平稳,亚基内部的色基的状态和疏水微环境都没有改变,但荧光传递效率降低,可能是由亚基表面局部构象变化、解离(四级结构变化)或者色素基团间的空间距离变化引起。(3)不稳定区(pH<3.5和 pH>10),吸光度和荧光强度都呈快速下降,色基在近紫外和可见光区的吸收峰位变动,蛋白构象处于快速崩溃期。PC-645在酸性条件下的稳定性高于在碱性环境下,是与隐藻藻蓝蛋白所处的特殊环境及生理功能相适应的。 相似文献
4.
藻胆蛋白是某些藻类特有的捕光色素蛋白,其中天然别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白的抗氧化活性已经被证明。实验以2,2-盐酸脒基丙烷(AAPH)为自由基生成者,应用藏红花素退色反应为检测清除氢过氧自由基的方法,探讨了在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达并纯化的带有6×His(6×组氨酸)标签和带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的重组别藻蓝蛋白及其α、β亚基的抗氧化活性。结果表明,带有His标签的6×Hisα-APC、6×Hisβ-APC和6×His-APC均显示出一定的清除氢过氧自由基的能力,其中6×Hisβ-APC清除氢过氧自由基的IC50值可达到27.2 mg/L,Ka/Kc(氢过氧自由基与重组别藻蓝蛋白和藏红花素反应的速度常数比)达到1.24,大于带有色素基团的天然APC清除氢过氧自由基能力(IC5057.5 mg/L);而带有MBP标签的重组别藻蓝蛋白亚基MBPα-APC和MBPβ-APC和MBP-APC(rAPC)则无明显的清除能力。结果首次证实了脱辅基蛋白具有清除氢过氧自由基能力,因而在天然藻胆蛋白中脱辅基蛋白是清除自由基的贡献者之一,这为进一步研究重组别藻蓝蛋白的抗肿瘤机理提供了线索。 相似文献
5.
采用体外克隆技术获得来自节旋藻6个品系的cpcB基因的257 bp的上游序列和217 bp的编码区序列,并和来自FACHB341的cpcB基因序列对应部分进行比较分析。结果表明,所获得的上游序列和编码区序列都有高度的保守性,而编码区所推导的氨基酸序列的保守性更高。启动子软件预测,在每一上游序列中都存在5条启动子序列,其中,FACHB439的启动子种类和结构与其他品系存在一定的差异。同时,FACHB439的翻译起始区mRNA二级结构与其他品系也有所不同。因此推测,在大多数品系节旋藻中藻蓝蛋白基因存在相同的表达调控机制,而品系FACHB439则可能存在一定程度的差异。 相似文献
6.
研究了海洋链霉菌分离株M095的基因转移系统。利用属间接合转移将具有oriT的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pIJ8600转入EscherichiacoliET12567(pUZ8002)中,获得供体菌。将供体菌与预萌发的菌株M095的孢子进行接合转移,将质粒pIJ8600转入菌株M095中,其转化率为1.99×10-4个接合转化子/受体。Southern杂交证明质粒pIJ8600已经整合到菌株M095的染色体上。同时,将来自Spirulinamaxima(Cyanophyta)的别藻蓝蛋白基因(apc)克隆在质粒pIJ8600的XbaI和BglII位点,产生质粒pAPIJ。用接合转移法将质粒pAPIJ转入菌株M095。通过SDS-PAGE分析,得到2个大小为22ku和17ku的蛋白,分别相对应于别藻蓝蛋白的α和β亚基。这些结果进一步证明菌株M095的遗传转化体系已经成功建立起来,这将为其他海洋放线菌遗传转化工作的研究奠定基础。 相似文献
7.
采用亚克隆方法,将别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)基因插入到毕赤酵母整合型表达载体pPIC6αA中,再用SacⅠ线性化,纯化后,用氯化锂法转化毕赤酵母菌株X-33,筛选表达APC的重组子。PCR和序列分析表明,APC基因已整合到酵母染色体中。重组子经甲醇诱导,用Western blotting在培养基上清液检测到APC,表明别藻蓝蛋白(APC)在毕赤酵母中可以表达。APC由两种亚基组成,分子量分别为19kDa和21kDa。重组子经摇瓶培养48h表达量达4.4mg/L。 相似文献
8.
藻胆体是红、蓝藻特有的光合作用捕光天线复合物。别藻蓝蛋白(APC)是组成藻胆体高效能量传递的核心结构的主要成分。本文以基因重组的别藻蓝蛋白(rAPC)的单体和三聚体为材料,通过稳态光谱、圆二色光谱以及超快时间分辨光谱研究了rAPC的结构构象和能量传递过程。结果表明,rAPC在测试条件下能保持和天然APC一致的光谱特性和活性构象;rAPC单体组装成三聚体后,其α84PCB和β84PCB可以组成激子色素对,通过激子分裂提高三聚体的能量传递效率;超快时间分辨光谱结果显示,在rAPC三聚体中,能量从620 nm传至650 nm的时间为300～600 fs,同时存在着19 fs的激子态的电子退相干过程。这些结果为揭示藻胆体的高效能量传递机制提供了数据基础。 相似文献
9.
为探究三倍体长牡蛎(Crassostrea gigas)性腺发育的分子调控机制，对AMPK基因及其靶基因在长牡蛎性腺发育过程中的表达特性进行研究。长牡蛎AMPK包含AMPK α、AMPK β和AMPK γ三个亚基。荧光定量PCR结果显示，这三个亚基的mRNA表达量在二倍体长牡蛎性腺发育过程中均呈下降趋势，在三倍体长牡蛎性腺发育过程中均呈上升趋势。二倍体长牡蛎性腺中AMPK α亚基Thr172位点磷酸化(p-AMPK α)水平在增殖期高，到成熟期几乎完全消失，这说明在长牡蛎性腺发育早期AMPK基因可能起到重要调控作用；在三倍体长牡蛎中，不育型三倍体(3nβ)的p-AMPK α水平显著高于可育型三倍体(3nα),推测AMPK α亚基磷酸化增强可能与三倍体不育密切相关。AMPK α亚基活性蛋白主要定位在滤泡细胞、精原/精母细胞和卵原/卵母细胞，说明该蛋白可能参与调控长牡蛎配子发生的早期过程。对AMPK潜在靶基因(GCS、CREB、SREBP1、ACC和Raptor)进行表达量分析，结果显示长牡蛎中p-AMPK α可能参与了CREB和SREBP1基因表达的调控。推测在可育型三倍体长牡蛎性腺发育... 相似文献
10.
《中国海洋大学学报(自然科学版)》2021,(8)
藻红胆素是一个开链四吡咯结构的发色团,其与脱辅基藻红蛋白结合使藻红蛋白具有光学活性,而血红素加氧酶基因ho对于藻红胆素的合成是至关重要的。本研究对实验室前期已获得的龙须菜中的血红素加氧酶基因ho-1的基因序列进行分析发现,其在藻类中比较保守,存在6个高度保守结构域;结构功能分析显示其具有15个可能的血红素(Heme)结合位点,其中第138位亮氨酸(L)既位于118～145位HemeO的扭结螺旋结构内,又在115～142位的高度保守的结构域内,而且经预测是可能的血红素(Heme)结合位点之一。为了进一步验证该位点的作用,我们拟对其进行定点突变,将第413位碱基由T突变成C,得到ho(M)基因,碱基突变后所对应编码的第138位氨基酸由亮氨酸(L,非极性氨基酸)突变为丝氨酸(S,极性氨基酸)。在此基础上,我们构建了重组质粒pET-ho-1、pET-ho-1-pebS、pET-ho-1-pebA-pebB及pET-ho(M)、pET-ho(M)-pebS、pET-ho(M)-pebA-pebB,将其转化到E.coli BL21中构建重组菌株E.coli ph、E.coli phS、E.coli phAB、E.coli ph(M)、E.coli ph(M)S和E.coli ph(M)AB进行表达,检测重组菌株的荧光发射光谱。结果表明,E.coli phAB和E.coli phS在595 nm处检测到藻红胆素的荧光特征峰,表明ho-1基因编码的血红素加氧酶可以参与催化藻红胆素的合成;E.coli ph(M)、E.coli ph(M)S和E.coli ph(M)AB与E.coli BL21一样无任何特征峰出现,这表明ho(M)中第413位碱基对应编码的第138位亮氨酸是血红素的结合位点,直接影响藻红胆素的合成,该位点的突变使得PebS和PebB/A两条催化途径均无法合成藻红胆素。本研究为阐明血红素加氧酶基因在合成藻红胆素过程中的重要性及龙须菜中藻红蛋白的合成机制,进而进行藻红蛋白的重组表达奠定了基础。 相似文献