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溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是水产养殖中致病性较强的一种条件致病菌,为更灵敏、高效地对其进行检测,研发出一种基于核酸适配体竞争置换作用的检测方法。首先设计并制备出磁珠-核酸适配体-荧光报告探针的检测复合物(MAP检测复合物),然后利用溶藻弧菌与其核酸适配体有较好的亲和特异性,在对样品进行检测时,样品中的溶藻弧菌就会竞争MAP检测复合物中的核酸适配体,从而置换出与该核酸适配体结合的荧光报告探针,再通过检测置换出的报告探针的荧光强度来表征溶藻弧菌的浓度,从而实现对溶藻弧菌的定量检测。结果表明,该方法对溶藻弧菌的检测限可达到1CFU/mL,与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、大肠杆菌(Escherichia coli)等水产养殖中的常见致病微生物没有交叉反应,并在1~20、20~100和100~1000 CFU/mL范围内都表现出较好的线性关系。另外还对MAP检测复合物的制备条件进行了优化,较为理想的制备条件为:100nmol/L核酸适配体与100nmol/L荧光报告探针按体积比1︰1混合结合30 min,制备出50 nmol/L的核酸适配体-荧光报告探针复合物,然后该复合物再与25μg/mL的磁珠按体积比1︰1混合结合60 min,制备出相应的MAP检测复合物。利用核酸适配体的竞争置换作用检测溶藻弧菌有较好的灵敏度和特异性,展现了较好的应用前景。 相似文献
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核酸适配体是采用分子进化技术从随机寡核苷酸文库中筛选得到的对靶目标有较高亲和力的寡核苷酸序列。研究核酸适配体筛选过程中高频序列的进化多样性,对于提高筛选效率,掌握核酸适配体的进化规律具有重要意义。利用Margalef丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度指数、Berger-Parker优势度指数,研究了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)核酸适配体筛选产物中高频序列的进化多样性,结果表明,随着筛选进行,高频序列的种类数、丰富度、多样性、优势度和均匀度在前六轮都呈现较为剧烈的波动,之后种类数、丰富度、多样性、优势度呈现逐步增加的趋势,而均匀度则呈逐步下降的趋势,说明竞争力强的序列在筛选竞争中逐渐占据优势,其种类数量不断增加;利用相对重要性指数(IRI)对高频序列进行了计算分析,根据IRI值可将高频序列分为5类:优势序列,重要序列,常见序列,一般序列和少见序列,其中前三种序列是筛选进化中的相对优势种群;最后对IRI较高的7种核酸适配体进行了二级结构预测,结果显示其二级结构中存在着大小、数量不等的环状结构,这些环的大小数量可能与其结合位点相关。相关研究结果对于鳗弧菌的病害防控及核酸适配体的筛选都具有重要意义。 相似文献
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鳗弧菌(Vibrio anguillarum)可感染鳗鲡、虹鳟和大菱鲆等多种水产动物,是水产养殖中的一种重要病原菌,对其进行快速检测是病害防控的前提和基础。利用鳗弧菌与其核酸适配体之间有较强的亲和特异性,首次建立了一种基于核酸适配体的可定量检测鳗弧菌的差减荧光法。该方法对鳗弧菌有较好的特异性,对鳗弧菌的检测荧光值是其他菌(溶藻弧菌、哈维氏弧菌、铜绿假单胞菌、变形假单胞菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和大肠杆菌)的4～11倍,对鳗弧菌的最低检测限为102CFU/mL,可用于102～108CFU/mL的范围内的定量检测。通过对不同盐度海水和鱼体组织样品进行加标回收检测,结果表明,回收率和相对标准偏差等指标均符合相应的标准,说明该检测方法可用于海水样品和水产动物组织中鳗弧菌的检测。 相似文献
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变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼内脏白点病的主要致病菌。核酸适配体,因其亲和力高、特异性好等多个优点,在微生物检测等多个领域都有较好的应用前景。以变形假单胞菌为靶目标,采用SELEX筛选方法,从高频序列中筛选获得了变形假单胞菌的5个核酸适配体,测定了这些核酸适配体对变形假单胞菌的亲和特异性及其亲和常数(Kd)和最大亲和力(Am),并对其二级结构进行了分析研究。结果表明,这5个核酸适配体对变形假单胞菌的亲和力是其他非目标菌(嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌、铜绿假单胞菌)的10倍以上,体现出了较好的亲和特异性。测定了5个核酸适配体(#1、#2、#3、#4、#5)的Kd和Am,相应的Kd值分别为(25.77±6.11)、(7.14±1.86)、(19.59±3.01)、(83.22±22.45)、(34.31±8.76) nmol/L,Am值分别为(789.23±38.46)、(1392.27±58.03)、(3012.50±106.19)、(1457.99±171.32)、(1070.91±70.16) nmol/... 相似文献
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