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1.
根据GenBank中发表的H5亚型禽流感病毒HA基因序列设计2对引物,用RT-PCR方法从禽流感病毒广东分离病毒株(A/Chicken/Guangdong/1997)中扩增HA基因cDNA片段,并将其克隆至pMD-18T载体进行核苷酸序列测定。结果表明:用2对引物所扩增的片段大小分别约为1300 bp和800 bp,经序列拼接获得的HA基因cDNA长度约为1601 bp,编码533个氨基酸,与国内己发表的11个代表株的核苷酸和氨基酸序列同源性为分别为96.9%~99.9%和86.5%~93.0%;HA基因编码的氨基酸序列的系统进化树也表明A/Chicken/Guang-dong/1997、A/Goose/Huadong/01/2000、A/Ck/Hk/37.4/2002、A/Chicken/Zhoukou/2/02、A/Duck/Guangxi/53/2002、A/Duck/Fujian/01/2002等毒株处于同一进化枝,亲缘关系较近;而与A/Silly/Chicken/Hongkong/SF189/01株处于不同进化枝,亲缘关系较远。 相似文献
2.
用RT-PCR方法从1个H5N1亚型禽流感病毒分离株A/Chicken/Guangdong/DH/1997扩增NA基因cDNA片段,将其克隆至pMD18-T载体,获得重组质粒pMD-NA,并对其核苷酸序列进行测定和分析。结果表明,该毒株的NA基因长度为1350bp,编码449个氨基酸,与其它H5N1亚型AIV分离株的核苷酸序列同源性为97.0%～99.4%,氨基酸序列同源性为97.7%～99.1%,提示禽流感病毒NA基因保守性较高。NA基因氨基酸序列的聚类分析表明该毒株与来自香港的A/Pheasant/HK/FY155/01和A/Ch/HK/FY150/01两个分离株处于同一进化枝,亲缘关系较近。 相似文献
3.
【目的】建立快速检测罗非鱼罗湖病毒(Tilapia Lake Virus,Ti LV)的RT-PCR方法。【方法】参照GenBank中罗非鱼罗湖病毒全基因序列,依据其假定蛋白基因片段3设计合成1对特异性扩增引物,提取罗湖病毒RNA,逆转录成cDNA,进行PCR扩增,通过优化扩增条件和扩增体系,建立快速检测罗非鱼罗湖病毒的RT-PCR方法。用该方法对自然感染罗湖病毒发病的罗非鱼样品进行RT-PCR扩增。【结果】RT-PCR扩增得到与试验设计相符的499 bp的特异性目的条带,而对健康罗非鱼、野生罗非鱼及其他病毒对照组的扩增结果均为阴性。测序比对结果表明,该方法检测结果准确,最低可检测出约10fg/mL的质粒DNA,具有较好的特异性和较高的敏感性。用该方法对332份临床样品进行RT-PCR检测,其中36份样品扩增出特异性的目的条带,经测序比对,检测结果正确。【结论】建立的检测方法可用于TiLV的检测。 相似文献
4.
Su(H)基因(Suppressor of Hairless gene)对生物体细胞的分化、增殖和凋亡起重要的调控作用。根据马氏珠母贝(Pinctada martensii)转录组数据库中注释为Su(H)的unigene序列设计基因特异性引物,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了马氏珠母贝Su(H)[pm-Su(H)]基因cDNA全长序列。结果表明:pm-Su(H)基因全长3 830 bp,其中开放阅读框含有1 920 bp,编码640个氨基酸残基,5'UTR为1 568bp,3'UTR为342 bp,含有27 bp polyA;预测其分子质量为70.6 ku,等电点为7.38;多序列比对显示,pm-Su(H)与其他物种的Su(H)有较高的保守性,与牡蛎(Crassostrea gigas)的同源序列高达80%;荧光定量PCR分析表明,pm-Su(H)在马氏珠母贝闭壳肌、鳃、珍珠囊、外套膜、肝胰脏、性腺、足、血淋巴等8组织中均有表达,其中以性腺中表达量最高,其次是珍珠囊和外套膜。 相似文献
5.
《广东海洋大学学报》2016,(4)
根据Gen Bank中对虾肠道上皮细胞微胞子虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)的基因保守序列,设计一对特异性引物,通过优化PCR扩增条件,建立快速检测凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)EHP的PCR方法。用该方法对EHP阳性虾进行PCR扩增,得到与实验设计相符的330 bp特异性扩增条带,而对白斑综合症病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)、对虾杆状病毒(BP)、"棉花虾"微孢子虫、黏孢子虫的阳性虾,以及健康虾的扩增结果为阴性。测序比对发现,PCR产物序列与Gen Bank EHP基因序列的同源性为99.8%,表明该PCR方法检测结果准确。敏感性试验表明,该方法最低可检测出约100 fg的EHP质粒DNA。用该PCR方法检测广东、广西、江苏、山东、海南等地的755份临床样品,共检出阳性样品21份。该PCR方法可用于凡纳滨对虾EHP的快速检测。 相似文献
6.
《广东海洋大学学报》2015,(4)
根据Gen Bank中公布的对虾杆状病毒(Baculovirus penaei,BP)基因片段序列,设计1对特异性检测引物,建立快速检测凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)对虾杆状病毒的PCR方法。用该方法对BP阳性虾进行PCR扩增,结果得到380 bp的特异性扩增条带,与实验设计相符,而对白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)阳性虾和健康虾的扩增结果为阴性。测序比对结果证实,该PCR方法检测结果准确,最低可检测出约1 pg的病毒DNA。利用建立的PCR方法对来自广东、广西、福建、海南和浙江的2 722份临床病料进行检测,共检出阳性病料133份,表明该PCR方法可用于对虾杆状病毒的临床快速检测。 相似文献
7.
【目的】建立一种快速、灵敏、特异的罗非鱼(Oreochromis spp)罗湖病毒定量检测方法。【方法】根据罗湖病毒节段8保守区设计一对特异性引物,建立检测罗湖病毒的SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了评价。【结果】标准曲线在2.5×10~8～2.5×10~0拷贝数之间有良好的线性关系(相关系数R~2=0.999),检测限为2.5×10~0个拷贝。试验内及试验间变异系数分别为0.11%～0.43%与0.54%～1.13%,重复性强;对水生动物其他病毒和细菌均无扩增反应,有很好的特异性。【结论】新建立的罗湖病毒实时荧光定量PCR检测方法特异性好、灵敏度高、重复性强,可用于TiLV的早期的快速诊断、流行病学调查和防控。 相似文献
8.
【目的】建立快速检测凡纳滨对虾野田村病毒的RT-PCR方法。【方法】根据GenBank中获得的凡纳滨对虾野田村病毒的基因序列,应用Oligo6.0软件设计合成1对特异性扩增引物,对反应条件和反应体系进行优化,建立快速检测凡纳滨对虾野田村病毒的RT-PCR方法。用该方法对感染野田村病毒的凡纳滨对虾进行RT-PCR检测。【结果】RT-PCR可扩增出与设计相符的413 bp的特异性目的条带,而对白斑症病毒(WSSV)阳性虾、对虾杆状病毒(BP)阳性虾、传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)阳性虾、肝胰腺细小病毒(HPV)阳性虾、黄头病毒(YHV)阳性虾、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)阳性虾、桃拉病毒(TSV)阳性虾和健康虾的扩增结果均为阴性。测序比对结果表明,该方法检测结果准确,最低可检测出约100 fg/mL的野田村病毒重组质粒DNA;用该方法对从福建、广东、海南、广西、江苏、浙江、山东等地的386份临床样品进行RT-PCR检测,共检出野田村病毒阳性样品64份。【结论】该方法可用于凡纳滨对虾野田村病毒的快速检测。 相似文献
9.
从GenBank上选取40对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的微卫星引物,分别在奥利亚罗非鱼(Oreo-chromis aureus)(83系)、红色奥利亚罗非鱼、奥利亚罗非鱼(02系)和尼罗罗非鱼的基因组上进行扩增。40对引物中有37对(92.5%)可进行有效扩增,32对引物(80%)可检测到个体间等位基因的多态性。其中引物UNH168与奥利亚罗非鱼的性别相关,在雌性个体中可扩增出二条大小不同的特异带(分别为135和171 bp),在雄性个体中则只有一条(171 bp)。将特异条带回收、克隆并测序,结果显示雌雄个体中171 bp条带的序列完全相同,包括103bp的侧翼序列和34个CA重复,在雌性个体中获得的135 bp条带则只有16个CA重复。引物UNH846、UNH860和UNH995可鉴别奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼,UNH890可鉴别出红色奥利亚罗非鱼。可见,大部分的尼罗罗非鱼微卫星位点存在于奥利亚罗非鱼中。 相似文献
10.
《广东海洋大学学报》2015,(6)
根据Gen Bank中类立克次氏体基因的保守序列,设计一对针对鱼类类立克次氏体PCR检测的特异性通用引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立快速检测鱼类类立克次氏体的PCR方法,并用该方法对类立克次氏体阳性罗非鱼(Oreochromis nilotica)进行PCR扩增,结果得到与实验设计相符的390 bp的特异性扩增条带,而对健康罗非鱼、乌鳢(Ophiocephalus argus)、海鲈(Dicentrarchus labrax)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)及其他对照组的扩增结果为阴性。测序比对结果证实,该PCR方法检测结果准确,最低可检测出约1 pg的类立克次氏体质粒DNA;利用建立的PCR方法,对来自广东、云南、海南、天津、江苏、安徽、湖北等地的252份临床样品进行检测,共检出阳性样品30份,提示该PCR方法可用于类立克次氏体的临床快速检测。 相似文献
11.
【目的】探究马氏珠母贝接头蛋白CIKS(PmCIKS)在马氏珠母贝免疫反应中的作用。【方法】采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得PmCIKS基因cDNA全长序列,运用生物信息学手段分析该序列,用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测PmCIKS基因在马氏珠母贝7个组织中的表达模式。【结果】PmCIKS基因cDNA全长为1 987 bp,其中5′UTR长为228 bp,3′UTR长为148 bp,包含24 bp的ploy A,开放阅读框(ORF)为1 611 bp,编码536个氨基酸,预测其分子质量约为61.3 ku,等电点为7.01。物种间CIKS有较高的保守性。PmCIKS在马氏珠母贝肝胰腺、性腺、闭壳肌、鳃、血细胞、外套膜和足中均有表达,其中在血细胞中表达量最高。 相似文献
12.
《广东海洋大学学报》2019,(4)
【目的】研究马氏珠母贝(Pinctada martensii)β2肾上腺素能受体(Pmβ2AR)的生物学功能。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得Pmβ2AR基因的cDNA的全长序列并对其序列特征进行分析,实时荧光定量技术(q RT-PCR)检测马氏珠母贝不同组织中β2AR基因m RNA的表达水平。【结果与结论】Pmβ2AR的cDNA全长2 426 bp,包括开放阅读框(ORF)2 091 bp,编码696个氨基酸,5′UTR长144 bp,3′UTR长191bp,预测分子质量79.0 ku,理论等电点9.18,多重序列比对结果发现β2AR在不同物种间的保守性较高。软件分析结果显示Pmβ2AR的氨基酸序列具有7个典型的跨膜结构域。q RT-PCR结果表明,Pmβ2AR基因在各组织中均有表达,在鳃中表达量最高,在肝胰腺和性腺中表达量也较高。 相似文献
13.
【目的】开发弓背青鳉（Oryzias curvinotus）三亚群体（下称“三亚青鳉”）遗传性别鉴定分子标记,为进一步挖掘其性别决定基因奠定基础。【方法】用染色体商（Chromosome quotient,CQ）法比较雌雄两性个体的全基因组重测序覆盖度,筛选潜在的性别特异性序列区域（CQ <0.1）并设计引物,通过PCR扩增验证引物区分三亚青鳉群体及其子代性别的适用性。【结果】经CQ分析筛选,CQ <0.1的特异性区域279个,设计引物279对。随机挑选的60对引物中,29对标记引物在三亚青鳉群体雄鱼中扩增得一个DNA条带,雌鱼无条带,均可鉴定三亚青鳉遗传性别。从29对引物中随机挑选2对引物（命名为Marker1和Marker2）进一步验证,引物Marker1、Marker2在雄鱼中扩增产物分别为791、556 bp,两对引物对三亚青鳉子代群体的扩增结果与亲本一致。用两对性别特异性标记对三亚群体的F2代全同胞家系94个个体进行扩增,结果发现F2群体自然性别比约1:1。【结论】性别特异性引物Marker1和Marker2均可对三亚青鳉群体进行遗传性别鉴定,在三亚青鳉野生亲本及... 相似文献
14.
根据草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)的vp5基因设计特异性引物,并扩增其开放阅读框序列(open reading frame,ORF),然后连接至pGBKT7载体上构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-vp5,转化至酵母菌Y2HGold,并进行PCR鉴定以及自激活性和毒性检测。PCR、酶切以及测序表明,pGBKT7-vp5重组诱饵载体构建成功。自激活性和毒性检测显示,阳性重组菌株pGBKT7-vp5/Y2HGold和阴性对照菌株pGBKT7/Y2HGold在SD/-Trp平板上出现大小相一致的乳白色菌落,且在SD/-Trp/X-α-Gel、SD/-Trp/AbA+/X-α-Gel平板上生长出蓝色菌落,而在SD/-Trp/-Ade/-His无菌落出现。表明重组菌株pGBKT7-vp5/Y2HGold表达的融合蛋白激活了报告基因AUR1-C和MEL1,没有激活报告基因ADE2和HIS3并且对宿主菌无毒性。该重组诱饵载体可用于酵母双杂交系统进一步筛选cDNA文库中与其相互作用的蛋白。 相似文献
15.
对克隆的 WSSV基因组 Xba 1.8kb片段进行序列测定 ,根据所测定的核酸序列 ,通过计算机软件分析 ,设计出一对 PCR引物。所设计的 PCR引物能从纯化 WSSV及患白斑症的对虾组织中扩增出长为 92 1bp的目的 DNA片段 ,并且能检测出 0 .2～ 0 .4μg病虾肌肉组织中的 WSSV。健康对虾、感染MBV的斑节对虾仔虾及 SINPV的扩增结果均为阴性。表明所建立的 WSSV PCR检测法灵敏而且特异。 相似文献
16.
根据体侧纵带颜色差异,暂将画眉笛鲷(Lutjanus vitta)分为黄带画眉笛鲷和褐带画眉笛鲷,应用RAPD技术,选用22个引物对黄带画眉笛鲷与褐带画眉笛鲷进行遗传多样性及分子标记研究。结果表明,黄带画眉笛鲷与褐带画眉笛鲷的遗传距离为0.832 9,其多态位点比例(P)分别为66.99%和85.28%,遗传多样性指数(H)分别为0.161 7和0.289 3,种内遗传距离(D)分别为0.243 5和0.431 9,表明褐带画眉笛鲷的遗传多样性比黄带画眉笛鲷丰富。共得到OPP14-629bp和OPP14-674bp等11个特异性分子标记,可用于两种笛鲷的鉴定。 相似文献
17.
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,从20对西大西洋笛鲷(Lutjanus campechanus)的微卫星引物中筛选适用于红鳍笛鲷(L.erythopterus)、勒氏笛鲷(L.russellii)、紫红笛鲷(L.argentimaculatus)和约氏笛鲷(L.johnii)基因组分析的微卫星引物,分析4种笛鲷的遗传多样性及系统发生。经反应条件的优化,从20对引物中筛选出17对可稳定扩增出特异片段的引物。通过测序证实扩增产物含微卫星位点后,以该17对引物对4个种的群体进行遗传多样性分析。其中16对可在约氏笛鲷、勒氏笛鲷、紫红笛鲷基因组中扩增出重复性好的特异性条带,分别有65%、65%、60%呈现出种内多态;15对可在红鳍笛鲷中扩增出重复性好的特异性条带,并且全部呈现出种内多态。四种笛鲷中,红鳍笛鲷的多态性最高,高度多态基因座占检测座位的66.67%;勒氏笛鲷的多态性最低,低度多态基因座占43.75%。获得3个种间特异性分子标记。用DS和DA两种方法计算4种笛鲷的遗传距离,构建了系统发生树。 相似文献
18.
以免疫两周的剑尾鱼为材料,提取脾脏总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出分泌型免疫球蛋白M(secretory immunoglobulin M,sIgM)重链基因的核心序列,再应用3’和5’快速扩增cDNA末端(RACE)方法扩增其末端序列,拼接后获得剑尾鱼sIgM重链全长cDNA序列。全长序列含有免疫球蛋白的信号序列:FKCIANH,得到的5个可变区序列可能来源于4个不同的VH家族。经用半定量RT-PCR分析sIgM在脾脏和头肾的表达变化,初步认为利用剑尾鱼头肾sIgM的mRNA表达变化替代检测血清抗体效价具有可能性。 相似文献
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【目的】准确高效分离红树林等海洋环境中产脂肽芽孢杆菌。【方法】将前期从红树林环境筛出具有抗菌活性的12株芽孢菌株作为研究菌株,采用溶血活性及排油作用对其中的可能产脂肽菌株进行初步筛选,并基于脂肽合成酶基因PCR扩增法对脂肽合成酶基因携带菌复筛,采用飞行时间质谱(TOF-MS)对所产脂肽进行鉴定。【结果】初步发现6株芽孢杆菌具有溶血活性,其中HY-5、HY-4和HN-9这3株具有排油能力,油层透明圈的直径分别为45、32和3 mm。PCR扩增检测到HY-5含有iturin、surfactin和bacillomycin D合成酶基因,HY-4含有iturin、surfactin合成酶基因,HN-9含有iturin合成酶基因。TOF-MS检测到HY-5和HY-4的发酵液含surfactin、iturin和bacillomycin 3种脂肽,HN-9的发酵液只含iturin。【结论】基于PCR与TOF-MS为核心的级联技术,建立一种海洋源脂肽产生菌快速筛选以及脂肽谱快速鉴定的方法,解决海洋源芽孢杆菌在常规培养基难合成脂肽造成的漏筛情况。 相似文献
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摘要：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，从20对西大西洋笛鲷（Lutjanus campechamus）的微卫星引物中筛选适用于红鳍笛鲷（L．erythopterus）、勒氏笛鲷（L.russellii）、紫红笛鲷（L.argentimaculatus）和约氏笛鲷（L.johnii）基因组分析的微卫星引物，分析4种笛鲷的遗传多样性及系统发生。经反应条件的优化，从20对引物中筛选出17对可稳定扩增出特异片段的引物。通过测序证实扩增产物含微卫星位点后，以该17对引物对4个种的群体进行遗传多样性分析。其中16对可在约氏笛鲷、勒氏笛鲷、紫红笛鲷基因组中扩增出重复性好的特异性条带，分别有65％、65％、60％呈现出种内多态：15对可在红鳍笛鲷中扩增出重复性好的特异性条带，并且全部呈现出种内多态。四种笛鲷中，红鳍笛鲷的多态性最高，高度多态基因座占检测座位的66．67％；勒氏笛鲷的多态性最低，低度多态基因座占43．75％。获得3个种间特异性分子标记。用风和DA两种方法计算4种笛鲷的遗传距离，构建了系统发生树。 相似文献