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1.
通过PCR技术从副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)基因组DNA上扩增耐热溶血素基因tdh,双酶切后定向插入到酵母表达载体pPICZaA中,构建重组表达质粒pPICZaA-tdh,经限制性内切酶SacI线性化后电转化毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)GS115,经PCR和测序鉴定耐热溶血素基因成功整合到毕赤酵母的基因组中。在甲醇诱导下进行tdh的表达,SDS-PAGE分析证明重组TDH(thermostable direct hemolysin,TDH)的分子质量约为23ku,经Western blotting鉴定VP抗体能与表达的TDH发生特异反应,说明tdh基因在毕赤酵母中的表达是准确的。溶血实验证明了表达的TDH具有溶血活性。本研究首次应用毕赤酵母表达耐热溶血素基因tdh,在培养基中获得分泌表达的耐热溶血素,为研究tdh基因的功能奠定了基础。 相似文献
2.
采用基因工程的方法,将副溶血弧菌的热稳定直接溶血素基因tdh2和鳗弧菌外膜蛋白基因ompU进行融合,在大肠杆菌中得到表达,并利用该融合基因构建二联DNA疫苗pEGFP．N1／tdh2-ompU。用DNA疫苗按10和50μg／尾的剂量通过肌肉注射免疫大菱鲆,对大菱鲆抵抗致病性副溶血弧菌和鳗弧菌的免疫效果进行研究。结果表明... 相似文献
3.
哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）是水产养殖动物（鱼、虾）的重要致病菌。已发现哈维氏弧菌对鱼类的致病性与其分泌的胞外产物中的溶血素相关，致病力最强的菌株VIB645有2个碱基序列非常相似的溶血素基因，vhhA和vhhB。本研究将vhhA克隆于pET-24d（＋）表达质粒，VHH溶血素蛋白作为1种带6组氨酸的融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到了过量表达。重组菌在鱼血平板上表现出很强的溶血活性，并且在卵磷脂平板上表现出磷脂酶活性。SDS-PAGE分析表明，表达蛋白的分子量约为43kDa。在17，25和37℃时重组的VHH溶血素蛋白都能得到很好的表达，达到最大表达量的时间分别为9,6和3h。在25℃进行诱导时，分泌到上清液中的表达蛋白的量最多。 相似文献
4.
中国卤虫(Artemia sinica)是重要的饵料生物,是当前海洋生物学研究的热点生物和重要的生物模型。本文报告了卤虫无节幼体整体荧光原位杂交(WFISH,whole-mount fluorescent in situ hybridization)技术,用于快速对卤虫早期发育相关基因的特定时空表达图式进行分析,有助于对卤虫早期发育相关基因功能进行鉴定。人工合成带有FITC标记的卤虫trh基因(trachealess gene)寡核苷酸探针,检测到trh基因在卤虫无节幼体的头部背面盐腺中表达。 相似文献
5.
副溶血弧菌广泛分布于海洋环境中,虽然大多数环境菌株并非致病菌,但它们常常携有毒力基因,从而具有潜在的致病性。本文从黄海(山东青岛)海水中分离到一株副溶血弧菌D3112,对其进行了全基因组测序、溶血实验和人工感染实验等。基因组测序分析发现D3112并不含有副溶血弧菌的致病性标志溶血素基因tdh和trh,这与PCR检测结果一致,但含有其他溶血素基因以及多种毒力相关基因。生物学实验显示,该菌可产生明显的溶血现象,而且具有蛋白酶、明胶酶、脂酶和淀粉酶活性,但是缺少卵磷脂酶活性。人工感染实验表明副溶血弧菌D3112具有致病性,感染斑马鱼的半致死剂量约为5×105CFU。药物敏感实验证明了D3112具有多重耐药性。本文对海洋环境中的副溶血弧菌D3112同时开展了基因型和表型研究,为准确评价环境细菌的潜在致病性提供了有用的数据信息。 相似文献
6.
最小弧菌热不稳定型溶血素表达载体的构建和高效表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据已发表的最小弧菌热不稳定型溶血素（Vibrio mimicusheat-labile hemolysinVmhA）核苷酸序列,设计和合成一对特异性引物,以最小弧菌96-6-3的基因组DNA为模板,PCR扩增得到热不稳定型溶血素基因片段,克隆于表达载体PQE-2/VmhA中,转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导,表达出预期大小50.2KD的融合蛋白.Westernblot检测显示,该蛋白与抗最小弧菌热不稳定型溶血素兔血清呈阳性反应,表明该蛋白具有溶血素的免疫原性,可作为基因工程疫苗的候选抗原. 相似文献
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日本对虾溶血素的活性测定及性能研究 总被引：32，自引：1，他引：31
于1997年10－11月,以青岛市红岛养殖场养殖的日本对虾为材料,采用分光光度法对其血淋巴中的溶血素进行活性检测,研究多种理化因子对其溶血性能的影响,以及日本对虾溶血素经细菌和虫草多糖肌肉注射刺激后的活性变化。结果表明,日本对虾溶血素的活性同对虾的健康状况密切相关。该溶血累经60℃以下处理溶血作用有所增强,在pH=5－9时溶血活性最高,Ca2＋、Fe2＋可增强溶血作用。注射大肠杆菌（2×107cells／尾）和虫草多糖能够诱导日本对虾溶血素的产生,使溶血活性有所提高;而注射哈维氏弧菌（7×107cells／尾）会导致对虾发病,降低溶血素的活性。 相似文献
8.
凡纳滨对虾血清凝集素、溶血素的特性研究 总被引：3，自引：0，他引：3
对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的血清凝集素和溶血素部分特性的研究结果表明,凡纳滨对虾血清凝集素热稳定性较差,温度高于50℃时,活性呈明显减弱至无活性,其最适温度为25~45℃;最适pH为8~9;盐度为24~48时,凝集活性最强,当盐度超过48或者低于6时,凝集活性较差;凝集素活性能被浓度高于16 mmol/L(包括16 mmol/L)EDTA-Na2,D-葡萄糖,D-果糖及D-半乳糖完全抑制。Cu2 使凝集素的活性完全丧失,而Ca2 和Mg2 能使凝集活性明显增强。45~60℃时,溶血素活性逐渐增强,60℃时达到最高;当pH 6~9时,溶血素的活性较强;盐度为18~36时,能增强溶血素的活性;EDTA-Na2对溶血素的活性几乎无影响;Cu2 使溶血素丧失活性,Mg2 能增强溶血活性,Mn2 对溶血素的活性没有影响,而Ca2 和Ba2 对溶血素有轻微的抑制作用。 相似文献
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10.
密度感应系统是细菌通过感受群体密度变化而控制基因特定表达的1种机制。对病原菌密度感应系统的研究有助于找到新的抗感染策略。目前哈维氏弧菌分泌的蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等致病相关因子是否受密度感应系统的控制尚不清楚。哈维氏弧菌有3个平行的密度感应系统。本研究通过检测3个密度感应系统基因突变株的胞外酶(如蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等)活性,发现明胶酶的活性受密度感应系统的信号分子HAI-1和AI-2的正控制,且受AI-2的控制程度更大;脂酶也在一定程度上受HAI-1和AI-2的正控制;卵磷脂酶受HAI-1的负控制;溶血素受HAI-1和AI-2共同的负控制。结果表明,哈维氏弧菌胞外分泌的几种毒力相关因子都受密度感应系统的调控,但控制方式各不相同。 相似文献
11.
从实验室保存的pBS-Trx重组质粒中克隆球石藻病毒EhV-Trx基因,构建毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-EhV-Trx,将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,诱导分泌表达并对重组蛋白进行二硫键还原酶活性分析。结果表明,EhV-Trx基因开放阅读框为591bp,编码197个氨基酸;在毕赤酵母GS115中成功诱导表达重组EhV-Trx,经SDS-PAGE分析目的蛋白分子量约为27.8kDa;重组EhV-Trx具有二硫键还原酶的活性,能有效打开胰岛素A、B两条链的二硫键,有望开发成一种新型的硫氧还蛋白脱敏制剂应用于食品安全领域。 相似文献
12.
为筛选与草鱼呼肠孤病毒GCRV096 VP6发生相互作用的宿主蛋白,先将VP6基因的PCR扩增产物,克隆至酵母表达载体p GBKT7以构建其诱饵质粒(p GBKT7-VP6);再将酵母菌Y2HGold(含p GBKT7-VP6)与酵母菌Y187[含草鱼肾脏细胞(CIK)c DNA文库质粒]进行人工诱导融合,然后经选择培养筛选阳性克隆。结果共筛选到4株阳性克隆,经测序、生物信息学分析,分别属于两条不同的核苷酸序列,其中之一所编码的产物与GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)同源性较高。可见,该酶极可能在GCRV096侵染宿主的初期发挥着重要作用。 相似文献
13.
核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶(RubisCO)(EC4.1.139)是光合细菌通过卡尔文循环固定二氧化碳的关键酶。本文采用PCR方法,从沼泽红假单胞菌株No.9中克隆到RubisCO基因(cbbM)序列(该序列已提交GenBank,登录号:GU061327)。采用同源建模法,建立了该RubisCO蛋白的三维结构模型,预测其活性位点。将cbbM基因亚克隆到表达载体pTV118N上,构建表达质粒pTV-CBBM,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株BL21(DE3)/pTV-CBBM,该菌株经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE检测。采用气相色谱法测定破菌上清中的RubisCO酶活。结果表明:①cbbM基因编码461个氨基酸,与沼泽红假单胞菌株DCP3和DH1的RubisCO蛋白序列相似性分别为98%和99%;②推测沼泽红假单胞菌No.9中RubisCO蛋白的活性中心由Asn112、Lys192、Asp194、Glu195、His288、Arg289、His322、Gly424、Ser369、Gly370和Gly394等氨基酸残基组成;③重组蛋白分子量约为50kDa左右,与预测相符;④破菌上清中的RubisCO酶比活高于原始菌株中的酶活,说明目的基因在大肠杆菌中得到了有效表达。 相似文献
14.
构建了文蛤铁蛋白的重组表达质粒 pGEX-4T-1-MmeFer, 在大肠杆菌 Escherichia coli 中获得了重组蛋白, 经酶解和质谱鉴定该蛋白为重组文蛤铁蛋白(rGST-MmeFer), 切除 GST 标签的重组文蛤铁蛋白(rMmeFer)具有氧化和吸收铁离子的功能。利用 rGST-MmeFer 制备了兔抗文蛤铁蛋白的多克隆抗体, 进而利用 Western blot 的方法对文蛤铁蛋白的组织表达分布进行了研究。结果表明, 铁蛋白在文蛤各组织中均有分布, 其中消化腺中表达量最高, 足中表达量最低。此外, 利用实时定量PCR 分析了文蛤消化腺、外套膜和鳃组织中铁蛋白 mRNA 的表达, 发现铁蛋白 mRNA 在外套膜中表达量最高, 消化腺次之, 鳃中表达量最低, 差异达到显著水平(P<0.05)。上述结果为进一步研究铁蛋白参与贝类贝壳形成的分子机制奠定了基础。 相似文献
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采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从鳜脑垂体总RNA中扩增生长激素(GH)成熟肽基因,将成熟生长激素的cDNA定向克隆到表达载体pET-32a(+),并转入大肠杆菌BL21(DE3)中。结果表明,鳜生长激素(GH)基因含开放阅读框(ORF)615个核苷酸,编码204个氨基酸,蛋白分子量为23kDa,等电点为7.07,其中酸性氨基酸占10.78%,碱性氨基酸占12.74%,疏水氨基酸为占44.12%,极性氨基酸占32.35%。在IPTG终浓度1.0mmol/L、温度37℃和培养时间4h的最佳诱导表达条件下,鳜生长激素基因(GH)在大肠杆菌中获得高效表达,重组菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到分子量约为43kDa的鳜生长激素与硫氧还蛋白(Thioredoxni,Trx)融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白58%。Western印迹分析也证实含6×His标签的重组融合蛋白能够很好地与抗6×His单抗发生反应。本研究为下一步鳜生长激素基因(GH)的生物学功能及应用奠定了基础。 相似文献
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为研究中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血蓝蛋白C末端(FcHC-C)的抗菌功能,将血蓝蛋白基因FcHC的2个C末端基因片段连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建酵母表达载体pPIC9K/FcHC-C。该载体经SalI酶切后,采用PEG法转化毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)。转化子经过PCR鉴定后,阳性克隆通过含有G418的YPD平板筛选,获得高拷贝重组子。重组毕赤酵母利用甲醇诱导表达目的基因。经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,利用酵母工程菌成功表达了血蓝蛋白C末端片段(rFcHC-C1和rFcHC-C2)。抑菌活性鉴定实验结果显示,重组蛋白rFcHC-C1和rFcHC-C2作为阴离子抗菌肽具有抗真菌和抗细菌的活性。 相似文献
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用蔗糖密度梯度离心法分离纯化白斑综合症病毒（WSSV）。设计并合成引物，提取WSSV中国株的基因组DNA作为模板，通过PCR，扩增克隆出VP28基因，利用BamHI和EcoRI切点将VP28基因插入克隆载体pUC19 的多克隆位点上，得到VP28基因的重组克隆质粒，对其进行双向DNA测序。测序结果表明，该基因含有615个核苷酸，与GenBank中已有不同来源的WSSV的序列片段同源性为100％。利用BamHI切点将VP28的基因插入到穿梭表达载体启动子PpsbA的下游，EcoRI酶切鉴定，得到正向连接的可在蓝藻表达的重组穿梭表达载体，命名为pRL-VP28。 相似文献
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采用酵母双杂交系统,对青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus)5个结构蛋白(VP3,VP6,VP9,VP11,VP12)间的双向互作进行了分析。将5个结构蛋白对应的ORF分别亚克隆至诱饵载体p GBKT7和猎物载体p GADT7,成功构建了10个酵母双杂交重组载体。将重组诱饵载体或重组捕获载体转化至酵母菌Y2H Gold中进行自激活检测,结果显示5个结构蛋白均不能激活酵母菌报告基因HIS3的表达,表明5个病毒蛋白均不具有自激活活性。通过酵母双杂交实验,从5个结构蛋白25个可能性互作对中,共筛选出2个双向互作对(VP11VP6,VP11VP12)和3个自身互作对(VP3VP3,VP11VP11,VP12VP12)。本研究是有关Ss RV结构蛋白互作的首次报道。 相似文献
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石斑鱼及暂养环境中副溶血弧菌分离鉴定与毒力评价 总被引：1，自引：1，他引：0
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)存在于海洋环境和海产品中,可引起人的食物中毒。本研究的目的是对某地石斑鱼暂养环境的副溶血弧菌的致病风险进行评价。结合弧菌选择性培养基TCBS、gyr B基因和16Sr RNA特定片段的序列分析方法对分离菌株进行鉴定;通过PCR检测毒力基因,血琼脂平板溶血实验、细胞感染实验、KM鼠灌胃实验分别检测各菌株的致病性、溶血性、细胞毒性与肠毒性。共鉴定出4株具有毒力的副溶血弧菌,分别为HS51-5、HS54-4、MJ01-1和MJ03-1。所有菌株都检测到溶血素基因(tdh和tlh)、三型分泌系统(T3SS)基因簇1(T3SS-1)的4个效应蛋白基因(vop Q、vop R、vop S和vpa0450)、和基因簇2(T3SS-2)的1个效应蛋白基因(Vop A)的分布,同时在HS51-5和HS54-4还检测到T3SS-2中的其他3个效应蛋白基因(vop C、vop T和vop L)。所有菌株都具有溶血现象、细胞毒性以及对小鼠的致死能力,而HS54-4、MJ01-1、MJ03-1对小鼠的毒力明显强于HS51-5。因此,从毒力基因检测、神奈川溶血、细胞毒性和对小鼠的毒力等4个方面的结果都表明副溶血弧菌具有致病性,说明石斑鱼暂养环境的副溶血弧菌具有致病风险,应加强对这些环境的监测。 相似文献