共查询到17条相似文献，搜索用时 390 毫秒
1.
牙鲆Myogenin蛋白在大肠杆菌中重组表达的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
采用大肠杆菌表达系统及pProEXTMHTc表达载体对牙鲆肌肉发生调节因子myogenin基因进行了体外重组表达研究。通过对诱导时间、IPTG诱导浓度以及诱导温度的优化,确定了最佳诱导条件为:诱导温度31℃,IPTG终浓度0.6mmol/L,诱导时间2 h。在该条件下,重组蛋白表达量最高且是可溶性的。Myogenin融合蛋白的成功表达为进一步深入研究其在牙鲆肌肉发育过程中的分子机制奠定了基础。 相似文献
2.
将牙鲆(Paralichthys olivaceus)RAG2 cDNA序列插入到体外表达质粒pProEXTM HT,在大肠杆菌(Escherichia coli) BL-21中进行体外表达,分析了诱导时间和 IPTG 浓度对重组蛋白产生量的影响,确定了最佳诱导条件为:诱导时间为3 h, IPTG诱导浓度0.2 mmol/L.本研究同时对RAG2重组蛋白的可溶性进行确认,并利用BD TALONTM 金属亲和柱纯化了RAG2蛋白.本研究结果为进一步深入研究RAG2蛋白的生物学功能奠定了良好的基础. 相似文献
3.
为了研究PHB2蛋白的生物学活性及后续抗体的制备,作者以前期构建的p MD18-T-Lm-PHB2质粒为模板,PCR扩增Lm-PHB2基因全长CDS区,PCR产物经Hind III和Eco R I双酶切后连接至表达载体p ET-32a,构建重组质粒p ET-32a-Lm-PHB2。将鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta Blue,经IPTG诱导表达后,表达产物通过SDS-PAGE和Western blotting进行检测,利用镍柱亲和层析纯化得到纯度较高的目的蛋白r Lm-PHB2。结果表明,经PCR、双酶切和测序鉴定,所构建的重组质粒p ET-32a-Lm-PHB2序列正确,表达产物存在于裂解菌液的上清和沉淀中,经SDS-PAGE和Western blotting证实在约47 ku处有目的蛋白r Lm-PHB2的表达条带。本研究构建了重组七鳃鳗(Lampetra japonica)PHB2蛋白的原核表达载体,并大量表达和纯化目的蛋白,为该蛋白后续的抗体制备及生物活性研究奠定了基础。 相似文献
4.
本研究克隆和表达了刺参原肌球蛋白(Tropomyosin,TRP)基因,进一步研究刺参再生过程中重要分子的功能.结果表明,TRP基因序列总长为1203bp,5 ′非翻译区为105bp,3 ′非翻译区为240bp,该序列包含一个855bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码284个氨基酸,分子量为33.27kDa,等电点为4.56.利用Escherichia coli对TRP进行了体外重组表达,在1mmol/L IPTG和37℃条件下诱导,能产生分子质量约为38kDa的重组蛋白,Western blot证明重组TRP与鼠抗刺参原肌球蛋白的多克隆抗体能特异性结合. 相似文献
5.
中国对虾细胞色素P450基因CYP4原核表达条件优化 总被引：1，自引：0，他引：1
根据克隆得到的中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）CYP4基因开放阅读框设计引物,构建了中国对虾CYP4基因原核表达载体p28a-CYP4,并对重组菌株Rosetta／28a-CYP4的原核表达条件进行了优化。结果表明：p28a—CYP4转化Rosetta后可实现CYP4基因的原核表达,SDS—PAGE分析显示其在56．0kDa处有显著诱导条带;通过对诱导温度、IPTG浓度、诱导时机（OD600）及诱导时间的优化表明,重组菌株Rosetta／p28a-CYP4的最佳诱导温度为37℃,最佳IPTG浓度为1．2mmol／L,最佳诱导时机及诱导时间分别为0．59和6h。 相似文献
6.
乳糖诱导重组别藻蓝蛋白基因在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
以重组别藻蓝蛋白表达工程菌JM109（DE3）／pET28-APC作为研究对象，对于JM109（DE3）菌株在乳糖诱导下表达重组蛋白的规律进行了研究。比较分析了不同生长阶段进行诱导，最佳乳糖浓度、诱导持续时间和诱导温度等参数对重组蛋白表达的影响。实验结果表明，采用JM109（DE3）为宿主菌，经过条件优化，乳糖诱导重组蛋白的表达量可以达到IPTG诱导的水平；较低的诱导培养温度能有效提高可溶性重组蛋白的表达。最后在摇瓶发酵结果的基础上，实现了乳糖诱导工程菌的5L全自动发酵罐培养。研究结果为在大肠杆菌大规模发酵中，运用廉价、无毒的乳糖作为诱导剂提供了一定的借鉴。 相似文献
7.
从实验室保存的pBS-Trx重组质粒中克隆球石藻病毒EhV-Trx基因,构建毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-EhV-Trx,将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,诱导分泌表达并对重组蛋白进行二硫键还原酶活性分析。结果表明,EhV-Trx基因开放阅读框为591bp,编码197个氨基酸;在毕赤酵母GS115中成功诱导表达重组EhV-Trx,经SDS-PAGE分析目的蛋白分子量约为27.8kDa;重组EhV-Trx具有二硫键还原酶的活性,能有效打开胰岛素A、B两条链的二硫键,有望开发成一种新型的硫氧还蛋白脱敏制剂应用于食品安全领域。 相似文献
8.
团头鲂(Megalobrama amblycephala)两种热休克蛋白 70(HSP70s)的原核表达、纯化及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
采用PCR方法扩增团头鲂组成型HSC70和诱导型HSP70基因完整的编码区片段,并分别克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),用1mmol/L IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达。采用Ni-NTA His Bind Resins亲和层析和DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析对目的蛋白进行纯化,并进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果表明,成功构建了团头鲂两种重组表达质粒pET-22b(+)/Ma-HSC70和pET-22b(+)/Ma-HSP70,表达融合蛋白的相对分子量均约为72kDa,并能与兔抗人HSP70多抗进行特异性结合,这两种HSP70s融合蛋白经纯化后的纯度均达到95%以上。本实验选择融合蛋白Ma-HSC70在25℃和Ma-HSP70在30℃下分别诱导7h作为可溶性表达的最佳条件。 相似文献
9.
对重组别藻蓝蛋白类荧光蛋白基因工程菌在装有150 mL液体培养基的250 mL摇瓶中的发酵条件进行优化.对起始pH值、接种量、诱导起始时间、诱导温度和时长以及IPTG浓度对重组荧光蛋白表达量进行了分析.结果表明,在装有150 mL液体培养基的250 mL摇瓶中,在起始pH值为7.5,6%接种量,培养温度为37℃,培养时长为3～5 h,诱导温度为22℃,IPTG浓度为0.2 mmol/L,诱导时长为7～8 h的条件下发酵重组别藻蓝蛋白类荧光蛋白,其表达量最高. 相似文献
10.
采用响应面法对重组大肠杆菌生物合成别藻蓝蛋白(holo-apc A)的发酵条件进行优化,提高了蛋白的表达量。以对重组别藻蓝蛋白α亚基在大肠杆菌中表达量影响较大的几种因素用于中心组合设计;中心组合设计试验结果表明诱导温度、培养基初始p H和诱导时机对诱导结果影响显著;经Design Expert 8.0软件优化后的最佳诱导条件为:诱导温度28℃,培养基初始p H 8.5,IPTG终浓度0.1 mmol/L,以及诱导时机3 h。最后验证试验得到的蛋白表达量在已有文献报道结果的基础上提高了70%~580%。中心组合设计-响应面法能够在有限的实验次数下,对影响生物过程的因子进行优化及对其交互作用进行评价,蛋白表达量达20.4 mg/L;IPTG用量由原来的1 mmol/L减少至现在的0.1 mmol/L,降低了发酵成本。 相似文献
11.
方形网纹溞(Ceriodaphnia quadrangula)可作为研究水生动物生物学的良好模式动物。为探索细菌介导表达的双链RNA(dsRNA)对方形网纹溞进行RNA干扰(RNAi)技术是否可行,本研究构建了方形网纹溞肌动蛋白(actin)基因的干扰载体Actin-L4440,并将其转入大肠杆菌HT115。此宿主菌经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后能表达actin基因部分片段的dsRNA。将此宿主菌投喂方形网纹溞,能抑制其体内actin基因的表达,并导致方形网纹溞死亡率明显提高。本研究成功构建了方形网纹溞的RNAi模型,为以后的研究提供了一定的参考。 相似文献
12.
采用PCR扩增、构建重组高效表达载体的方法,进行了牙鲆多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的克隆、原核表达研究,并利用SDS-PAGE、western-blot及ELISA方法对纯化的重组蛋白特性进行了分析。结果表明,PCR扩增出pIgR开放阅读框(ORF)基因全长为1005 bp,所构建的pET-32(a)-pIgR重组质粒经PCR和双酶切鉴定含有ORF全长基因。SDS-PAGE结果表明,表达的目的蛋白相对分子质量为58 kDa,与理论预期值一致,IPTG诱导6h后表达量趋于稳定,经亲和层析纯化得到高纯度的重组蛋白。Western-blot结果表明,重组pIgR能够与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应;ELISA结果表明重组pIgR能够与牙鲆IgM发生特异性结合。本研究获得了纯化的重组pIgR,证明其具有IgM结合活性,为下一步研究牙鲆pIgR的转运机制及在黏膜免疫防御中的作用机理提供了分子基础。 相似文献
13.
大黄鱼(Pseudosciaena crocea)热激蛋白的基因克隆、原核表达及抗血清的制备 总被引：1，自引：1，他引：1
应用trizol裂解法提取象山港网箱养殖大黄鱼肝脏总RNA,采用RTPCR获得大黄鱼cDNA;通过设计特异引物进行PCR扩增,将PCR产物转化到质粒并直接测序,得到1.7kb的目的基因;同时将此目的基因连接到表达质粒pSBET中,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达以及表达产物的分析。克隆基因的表达产物经SDSPAGE分析表明,HSP基因的蛋白分子量为60kDa左右,与阅读框的编码大小一致;表达蛋白经纯化后免疫小鼠制备抗血清。Westernblotting检测结果表明,制备的抗血清与HSP蛋白起较强的特异性反应。HSP基因的系统进化分析表明,大黄鱼与非洲爪蟾最为接近,从侧面印证了脊椎动物中两栖纲动物与鱼纲动物的亲源关系。通过大黄鱼HSP基因的提取和分析,可为以后制备出核酸探针、筛选和克隆出一批具有优良性状的基因、构建基因文库等研究工作奠定基础。 相似文献
14.
神经肽Y(Neuropeptide Y,NPY)被普遍认为是一种重要的促食因子,在调节鱼类的摄食行为方面起着至关重要的作用。为进一步研究牙鲆NPY蛋白的生物学功能,作者克隆了牙鲆NPY成熟肽序列(m-NPY)及含有信号肽的全长序列(f-NPY),利用原核表达系统分别进行体外重组表达,筛选出诱导剂IPTG最佳诱导浓度为0.8 mmol/L及最佳诱导时间3 h;此外,根据牙鲆NPY第49-64位氨基酸序列制备了多克隆抗体并通过Western blot验证该多抗能够有效检验重组NPY及牙鲆体内NPY的表达。研究结果为研究重组牙鲆NPY蛋白在牙鲆水产养殖产业中的应用及检测提供了依据。 相似文献
15.
本研究将新发现的鳗弧菌毒力相关基因mltD(膜绑定溶胞壁质转糖酶基因)克隆于表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以镍琼脂糖亲和层析柱纯化表达的融合蛋白;经SDS-PAGE分析,纯化的融合蛋白为单一条带,分子量约为70.2 kDa,与理论预测值相符。生物信息学分析表明,鳗弧菌MltD由523个氨基酸组成,与其他弧菌的MltD氨基酸序列有较高的相似性;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;功能区包括N端的信号肽区域、1个糖基转移酶结构域和C端的3个溶解酶结构域;蛋白的N端具有一段脂蛋白信号肽,信号肽外的其他部分为非细胞质蛋白。鳗弧菌MltD蛋白为亲水性;不稳定系数为27.40,属于稳定性蛋白;整个蛋白分子共有24个可能的抗原决定簇,具有较强的抗原性。推断MltD蛋白为1种外周膜脂蛋白,在弧菌中相对保守,抗原性强,可应用于抗弧菌病疫苗的开发研制。 相似文献
16.
根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)生长激素(GH)基因的c DNA全长序列设计引物克隆得到其全长552个碱基成熟肽序列。利用RT-PCR方法将扩增片段克隆到原核表达载体p ET-28a上,实现了GH成熟肽在大肠杆菌BL21(DE3)中的融合表达。融合蛋白分子量为26 k Da,在IPTG诱导4h时目的蛋白表达量最高,占细菌总蛋白的41.5%,主要以包涵体形式存在。Western-blotting分析表明GH融合蛋白可特异性地被6×His抗体识别。诱导表达后的菌液沉淀经纯化和复性后,获得大小为26 k Da的纯化GH融合蛋白。以ELISA方法检测纯化后的GH融合蛋白显示其具有免疫学活性。本研究为认识半滑舌鳎生长轴的调控机制提供了基础资料。 相似文献
17.
1 IntroductionNervous necrosis virus( NNV) is one of theworldwide pathogens in cultured species and breed-ing from the late 1980s (Bovo et al.,1999; Tan etal., 2001; Breuil et al., 2001; Munday et al.,2002; Lin et al., 2001). The virus is isometric andnon… 相似文献