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1.
采用生物素磁珠富集法,用生物素标记的(GT)15和(CT)15两种探针与细角螺基因组 MseI 酶切的300~1200bp 片段杂交,杂交复合物与链霉亲和素磁珠结合,捕获含有重复序列的微卫星片段。最后将磁珠捕获到的重复序列与PMD19-T载体连接后克隆到DH5α中构建微卫星基因组文库。通过PCR检测出354个阳性克隆,从中随机选取248个片段大于500bp的阳性克隆进行测序,结果显示,在220个成功测序的阳性克隆中共获得278个微卫星序列,其中完美型171个,占61.5%;非完美型81个,占29.1%;复合型26个,占9.4%。除探针使用的GT和CT的重复序列外,还筛选到三碱基GTT、TGG、GAA、CAA;四碱基TCTA、ACAG、TAGA、GTGA、GTCT、GATA及五碱基TTTTG的重复序列。在278条序列中共有82条可以设计引物。 相似文献
2.
采用磁珠富集法,利用生物素标记的(GT)15寡核苷酸探针从三疣梭子蟹基因组DNA的Sau3A1酶切的500-1000bp片段中筛选微卫星序列.洗脱的杂交片段克隆到PMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出阳性克隆进行测序.在56条测序序列中有49条非冗余序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点,阳性序列比例达到87.5%.其中perfect类型微卫星最大的重复次数为47次.在47条非冗余序列中,共有40条(85.1%)微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计.本研究中筛选的微卫星位点将为下一步的三疣梭子蟹种群遗传结构分析、经济性状的QTL定位提供遗传标记. 相似文献
3.
采用磁珠富集法,利用生物素标记的(GT)15寡核苷酸探针从泥蚶基因组DNASau3A1酶切的500—1000bp片段中筛选GT/CA微卫星位点。洗脱的杂交片段克隆到PMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出阳性克隆进行测序。在139条序列中有115条序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点,阳性序列比例达到82.7%。其中perfect类型微卫星最大的重复次数为35次。在112条非冗余序列中,共有100条(88.5%)微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计。 相似文献
4.
采用磁珠富集法及利用生物素标记的(CA)15寡核苷酸探针从波纹唇鱼(Cheilinus undulatus)基因组DNA Bsp143Ⅰ酶切位点的400~1000 bp片段中筛选CA/GT微卫星位点。洗脱的杂交片段克隆到PMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选出阳性克隆进行测序。在120条序列中有88条序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点,阳性序列比例达到73.33%。其中完美型(perfect)类型微卫星最多的重复次数为26次。在88条非冗长序列中,共有28条(31.82%)微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计。用波纹唇鱼3个个体的混合基因进行引物筛选,其中的24对具有清晰的扩增条带。将筛选的24对引物对波纹唇鱼1个群体的39个个体进行遗传多样性分析,其中4对引物扩增产物为单态,20对扩增产物呈多态性;20对扩增多态的引物在39个个体中扩增出等位基因数为2~12,平均有效等位基因数为3.5。该波纹唇鱼群体的PIC、Ho、He的平均值分别为0.0782、0.8513、0.5667。这20个微卫星位点适于波纹唇鱼群体遗传结构的研究分析。 相似文献
5.
采用生物素标记的(AC)_(15)探针和磁珠富集法构建合浦珠母贝(Pinctada fucata)基因组DNA微卫星富集文库。随机挑选2097个克隆进行筛选,得到483个候选克隆(23.03%),对其中135个阳性克隆测序分析发现122个克隆含有微卫星重复单元(90.37%)。进一步通过序列比对,最终得到65个具有特异微卫星序列的阳性克隆(53.28%),其中包含85个微卫星DNA结构域,其中完美型(perfect)70个,占82.36%;非完美型(imperfect)7个,占8.24%;混合型(compound)8个,占9.41%,重复次数主要分布在5~20(95.74%),平均重复次数为7.83,(AC/GT)n重复所占比例最高(75.53%)。基于微卫星两端的侧翼序列,利用Primer Premier 5.0设计引物,获得11对具有多态性的微卫星引物。本研究为开展合浦珠母贝分子育种及资源评价分析提供了基础资料。 相似文献
6.
大珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选 总被引：2，自引：0，他引：2
采用生物素标记的(CA)15探针和磁珠富集法构建了大珠母贝(Pinctada maxima)微卫星DNA文库,随机挑选1200个菌落,经PCR筛选得到298个候选克隆,成功测序246个,分析获得251个微卫星序列,其中完美型、非完美型和混合型分别占63%、32%和5%。除探针中使用的CA重复外,还得到AT、GT、TC、AG、GC、TAA、CAA、AGG、GATA、GACA、GTGC、CGTC、GACG、CTGT等重复序列。设计引物90对,挑选其中30对合成并筛选出21对能在大珠母贝基因组有效扩增的引物。种群PCR扩增后利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行检测,获得了10个多态位点,共检测出59个等位基因,片段长度范围为133~444 bp。各位点等位基因数2~8个,平均等位基因数5.9个;有效等位基因数为1.342 3~6.000 0,平均为4.124 0;多态性信息含量(CPI)为0.222 5~0.811 8,平均0.7179;期望杂合度(He)为0.259 3~0.847 5,平均0.717 9;观测杂合度(Ho)为0.300 0~0.800 0,平均0.533 3。这些微卫星多态性标记的获得,为进一步开展大珠母贝遗传育种、保护生物学和种群遗传多样性等研究奠定了一定基础。 相似文献
7.
用FIASCO(Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing Repeats)技术开展了合浦珠母贝Pinctada fucata基因组微卫星标记的分离与筛选研究.合浦珠母贝基因组DNA经限制性内切酶MseI酶切后与接头连接, 用生物素标记的(CA)15探针与其杂交, 然后用磁珠富集、洗脱获得单链目的片段, 经PCR扩增后形成双链, 最后进行克隆转化, 构建微卫星富集文库.挑选克隆用探针引物(CA)15 和载体引物进行第2次筛选, 获得阳性克隆357个, 测序结果表明, 297个克隆(83.2%)含有微卫星序列, 包括479个微卫星DNA结构域.其中完美型微卫星有370个(77.3%), 非完美型95个(19.8%), 复合型14个(2.9%).合成引物49对, 有31对(63%)扩增出目的产物, 其中9 对在种群中(n=32)具有扩增多态性, 其多态信息含量PIC值在0.375―0.809之间, 平均为0.536;等位基因数在2―9个之间, 平均为4.889个;观测杂合度介于0.200―0.600之间, 平均为0.415;期望杂合度的变化范围为0.454―0.844, 平均为0.598.表明FIASCO技术适合于合浦珠母贝微卫星标记的分离与筛选. 相似文献
8.
长牡蛎(Crassostrea gigas)微卫星克隆快速分离及特性分析 总被引：22，自引：2，他引：22
采用磁珠杂交选择和PCR筛选法，从长牡蛎DNA选择片段文库中，快速分离含有微卫星序列的阳性克隆。结果表明，在筛选的200个白色菌落中，56个克隆含有重复次数5以上的微卫星序列，其中41个(20．5％)有随机侧翼区，可以进行引物设计，12个缺乏足够的侧翼序列，3个为中断的微卫星序列。此外，还获得两个小卫星克隆。在获得的微卫星序列中，完全的占54．7％，不完全的占20．8％，复合的占24．5％。除探针中使用的CA重复单元外，还观察到CT、ACT、CGCA、CACT、GACT、GCAC、CCTTA和CCTCA的重复序列。微卫星重复次数主要集中在5-30次之间，占71．7％，最高为60次。本研究中构建的长牡蛎(CA)n富集微卫星文库将为以后开发未知微卫星标记提供帮助。 相似文献
9.
缢蛏微卫星序列分离及特性分析 总被引：4，自引：0，他引：4
分析了缢蛏(Sinonovacula constricta)基因组文库中微卫星序列的特性及微卫星引物的遗传特征.采用磁珠富集珐和PCR 筛选法,以CA15为探针,快速分离含有微卫星序列的阳性克隆.结果表明,在筛选的210个白色菌落中,得到58个微卫星序列,阳性克隆率为27.6%,核心重复序列为两碱基和三碱基的微卫星居多,其中完美型占39.7%,非完美型39.7%,复合型占10.3%,非完美型与复合型共存的占10.3%.微卫星重复次数主要集中在20～40次之间,占66%,最高为63次.除探针中使用的CA重复单元外,还观察到AG/TC,AT/TA,AAC/TTG,CAA/GTT,TGA,AAT,AGAA,GTTT/CAAA,AAAT/TTTA,TTTC,CCTA,TCTA,TCCC,TGCC,GTTTCT,CTGTT,CACACC,TATACA,TTTTG的重复序列.利用Primer Premier5.0设计引物24对,经过初步筛选得到适合的微卫星引物18对,为今后未知微卫星标记的开发,群体遗传结构的分析,优良品种的选育提供基础. 相似文献
10.
三角褐指藻磷酸甘油酸变位酶基因可能侧翼序列的筛选、克隆以及序列测定 总被引：2，自引：2，他引：2
采用RT PCR的方法从酵母中成功地得到了磷酸甘油酸变位酶的cDNA基因 ,分别用32 P和地高辛 ddUTP标记以用作探针。以32 P标记的探针筛选三角褐指藻基因组文库 ,获得了 4kb的阳性DNA片段 ;进一步分析发现 ,该 4kb片段的真正阳性区域是位于片段端部的30 6bp的序列 ,因此认为该序列为三角褐指藻磷酸甘油酸变位酶基因的侧翼部分。克隆该30 6bp的DNA片段 ,并且测定其序列。结果表明 ,该 30 6bp的DNA片段包含两个同向重复序列 ,每个重复序列的大小为 1 1 6bp ,在每个重复序列中均含有GGTTCAATGT区域 ,这与一般常见的真核基因 5′端的CAATbox有相似之处。 相似文献
11.
探究横带髭鲷(Hapalogenysanalis)的种质资源情况以及群体的遗传多样性和遗传结构,对于其增养殖实践尤为重要。微卫星分子标记在研究物种种质情况及遗传信息方面有很大优势。采用基因组survey测序方法开发横带髭鲷微卫星位点,结果表明,横带髭鲷基因组大小为543Mb;微卫星位点丰富,共检测到280 378个完美型微卫星位点,相对丰度为415.17个/Mb。二核苷酸重复是最丰富的微卫星类型(56.05%),其次为单核苷酸(29.20%)、三核苷酸(10.28%)、四核苷酸(2.99%)、五核苷酸(1.03%)、六核苷酸(0.45%)重复,短序列重复类型占95.53%。重复单元中A/T, TG/CA为优势重复单元,分别占总微卫星位点数的22.37%和21.98%;10次重复和6次重复的微卫星位点数量最多,占横带髭鲷基因组微卫星总数的14.60%和12.46%。利用筛选出的20对多态性微卫星位点扩增一个供试群体进行群体遗传学检测。结果表明,各位点等位基因数从5到13不等,均值为8.75个;平均观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.808和0.863;多态信息含量(PIC)均... 相似文献
12.
采用FIASCO方法构建了中国鲎(Tachypleus tridentatus)(CA)_n微卫星富集文库,对214个阳性克隆进行测序,筛选获得60条含有微卫星的序列,其中可设计引物的序列共38条。38对微卫星引物在37个中国鲎个体中PCR检测发现,只有9个位点具有多态性,其等位基因数为5—14个,每个位点平均具有8.1个等位基因。9个位点之间不存在连锁。利用该9个具有多态性微卫星标记分析了中国沿海9个中国鲎地理群体的种群遗传多样性和遗传结构。结果表明:中国沿海的中国鲎种群遗传多态性水平仍较高, 9个地方群体间无遗传差异,它们之间未见显著分化,且有着较高的基因流;推测人为的迁移是造成遗传无分化的主要原因。我们建议中国鲎已绝迹的海域可从其他海域引入中国鲎个体来恢复地方群体资源。 相似文献
13.
利用FIASCO (Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats) 技术建立拟穴青蟹Scylla paramamosain基因组文库, 并与生物素标记的(CA)15 寡核苷酸探针杂交, 联合磁珠富集法构建拟穴青蟹微卫星富集文库。测序194 个阳性菌落, 分析其中的150 条序列, 结果表明: 两碱基重复类型占90%以上, 其中重复拷贝数在30 以上的占27.45%; 含微卫星座位189 个, 其中完美型146 个、非完美型28个和复合型15 个。设计125 对引物扩增一个拟穴青蟹野生群体(含20 个个体), 其中的19 对引物能稳定扩增且片段大小基本符合理论长度。遗传变异分析表明, 17 个位点表现出高度多态性, 16 个位点显著偏离Hardy-Weinberg 平衡(P<0.05), 4 组两两位点间存在连锁不平衡现象(P<0.0026, 经Bonferroni 法校正), 7 个微卫星位点可能存在无效等位基因。若排除混合微卫星位点的引物对以及扩增位点PIC (polymorphism information content)值在0.5 以下的引物对, 则13 对引物能用于拟穴青蟹群体遗传学等研究。 相似文献
14.
黑棘鲷(Acanthopagrusschlegelii)是广泛分布于西北太平洋的暖温性中下层经济鱼类,也是我国沿海重要的海洋捕捞鱼类和增养殖对象。然而,目前有关黑棘鲷的微卫星标记研究报道较少,难以对其种质资源状况作出精确评估。本研究采用SLAF-seq技术测序共获得22489个二至六碱基重复的黑棘鲷微卫星序列,短重复序列(二、三碱基)占总微卫星序列的90.8%,长重复序列(四至六碱基)占有9.2%。经过157对随机合成引物的多态性筛选,开发出49个高多态性的黑棘鲷微卫星标记,其中短重复序列位点有25个,长重复序列位点有24个。每个位点的等位基因数(Na)为2—20(均值为8.3),观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.097—0.938和0.122—0.922(均值分别为0.663和0.701),多态信息含量(PIC)为0.118—0.897(均值为0.655)。经Bonferroni校正后,有47个位点符合哈迪-温伯格平衡(HWE),各位点间未检测到连锁不平衡现象,仅2个位点偏离HWE。结果表明,所开发的大部分微卫星标记具有高多态性,蕴含的遗传信息含量较为丰富,能够为黑棘鲷的种群遗传资源评估提供数量充足、类型多样的有效分子标记。跨物种扩增结果显示,有43个黑棘鲷微卫星标记可在9种鲷科鱼类中成功扩增,其中28个标记在太平洋棘鲷(Acanthopagruspacificus)、黄鳍棘鲷(Acanthopagruslatus)和澳洲棘鲷(Acanthopagrusaustralis)中具有较好的通用性,2个标记在平鲷(Rhabdosargussarba)、蓝点赤鲷(Pagruscaeruleostictus)、真赤鲷(Pagrusmajor)、二长棘犁齿鲷(Evynnis cardinalis)及黄牙鲷(Dentex hypselosomus)中具有通用性。这些通用性标记可为阐明鲷科属、种间的系统进化关系和棘鲷属鱼类的群体遗传学分析提供新的标记来源和研究角度。 相似文献
15.
对均一化转录组测序获得的47604个曼氏无针乌贼的微卫星序列进行分析,结果表明,乌贼转录组中微卫星位点丰富,每1402nt的EST中就有一段不小于12nt长度的微卫星序列。单碱基重复是EST微卫星序列的主要形式(38.69%),其次依次为三碱基(31.14%)、二碱基(26.35%)、四碱基(3.29%)、五碱基(0.38%)、六碱基(0.14%)重复,短序列类型占微卫星总量的96.18%。同碱基类型的微卫星序列组成又存在差异,AC(54.51%)和AG(31.22%)是最常见的二碱基重复序列;而AGC(16.37%)和AAC(14.06%)是最常见的三碱基重复序列。通过引物设计和体系优化,共筛选到了24对多态性微卫星位点,对来自福建漳州海域的35只野生曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)个体进行群体遗传学检测,结果表明,每个位点检测到的等位基因数3—10个不等(均值5.9个);平均杂合度观测值(Ho)和期望值(H_e)分别为0.518和0.681。除2个位点外所有位点的多态信息含量(PIC)都大于0.5。Hardy-Weinberg平衡检测表明,仅4个位点有显著偏离(P0.05),未检测到连锁不平衡现象。这表明转录组高通量测序技术适于乌贼微卫星位点的开发,获得的SSR标记可用于今后乌贼资源遗传评估和科学有效管理过程。 相似文献
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条斑紫菜(Porphyra yezoensis)dbEST中筛选微卫星位点及引物种间转移扩增 总被引：9，自引：0，他引：9
采用电子查询的方法，借助Blast软件从条斑紫菜表达序列标签数据库的20979条序列中筛选微卫星位点，共发现非冗余微卫星位点211个，占整个条斑紫菜EST数据库的1．01％。其中双碱基重复微卫星位点共有35个，占查找微卫星序列总数的16．6％；三碱基微卫星有176个，占83．4％。双碱基重复微卫星中AG／CT形式最多，而三碱基中GGC／GCC最多。从筛选出的微卫星位点中选取序列设计合成引物，用在坛紫菜上进行引物种间转移扩增研究。在总共15对引物中有13对引物在两个种间都有扩增产物。结果表明，微卫星位点在这两种紫菜之间具有很高的同源性。获得的微卫星引物可用来进行种群遗传多样性研究、谱系鉴定和遗传图谱的构建。而微卫星标记的共显性可用来进行紫菜二倍体丝状体纯合性检验，为纯系紫菜品系的鉴定提供分子生物学鉴定方法。 相似文献
17.
中国对虾微卫星DNA的筛选 总被引：35，自引：5，他引：35
于2000年2月以中国科学院海洋研究所水族楼暂养的中国虾对材料，采用常规方法从尾部肌肉中提取DNA，构建小片段部分基因组文章，采用人工设计合成的（CT）7，（AT）7重复征段作引物，利用RCR法对中国对虾小片段部分基因组文库进行筛,一实验首冼 对中国对虾中获得31个微卫星序列，分别分析于18个阳性重组克隆中，其中perfect共23个，占74％，imperfect2个，占7％，compound perfect1个，占3％，compound imperfect5个，占16％，结果还表明，在中国对虾基因组DNA中，（CT）n,(AT)n)形式的微卫星序列的含量非常丰富。 相似文献
18.
采用FIASCO (Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats)技术和磁珠富集方法开发拟穴青蟹微卫星位点.结果表明,400bp以下长度的序列含微卫星的概率超过400bp以上长度的序列;从二碱基重复类型到五碱基重复类型,完美型微卫星的概率在增加.利用设计的28对引物扩增一个供试群体,其中12对引物能稳定扩增且片段大小基本符合理论长度,10个微卫星位点表现出高度多态性,9个微卫星位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05),两组两两位点间存在连锁不平衡现象(P＜0.0042,经Bonferroni法校正).Micro-Checker分析揭示其中的5个微卫星位点可能存在无效等位基因.排除混合微卫星位点的引物对以及扩增位点PIC值在0.5以下的引物对,8对引物能用于拟穴青蟹群体遗传学等研究. 相似文献