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为建立Taura综合征病毒（Taura syndrome virus,简称TSV）的TaqMan—MGB探针荧光定量RT-PC方法,根据TSV衣壳蛋白基因保守序列设计引物和TaqMan—MGB探针,扩增产物长度为118bp。将PCR产物克隆到pGM—T载体,重组质粒经筛选鉴定、SalⅠ单酶切,得到线性化转录模板DNA,经体外转录获得标准品RNA。以体外转录的RNA作为模板,进行一步法荧光定量RT-PCR反应,根据RNA模板拷贝数与Ct（Cycle threshold,Ct）值制备了标准曲线,制作的标准曲线在2×10^1拷贝／μL≤TSV RNA≤2×10^7拷贝／此的范围内具良好的线性关系,可以用于TSV的定量分析,检测灵敏度为20个拷贝数。特异性、重复性试验结果表明,该方法对SPF对虾组织RNA没有扩增反应,表现出良好的特异性;组内和组间实验变异系数分别为0．32％～1．84％和0．79％-2．71％。利用TaqMan—MGB探针建立检测TSV的一步法荧光定量RT-PCR方法可用于对虾TSV的检测。 相似文献
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建立了Taqman 实时定量RT-PCR方法检测诺沃克样病毒(Norwalk-like Virus,NLV)的方法,并对中国的牡蛎样品进行了分析.选取GⅡ型NLV的RNA聚合酶区域,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针,建立了定量RT-PCR反应体系.将含有NLV扩增片段的质粒10倍梯度稀释,作为标准品进行反应以确定检测灵敏度并制备标准曲线.结果表明,质粒密度在6×106,6×105,6×104,6×103,6×102,6×101,6个拷贝之间,共7个数量级的范围内,定量RT-PCR反应都有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为6个拷贝.制备的标准曲线中,病毒拷贝数(X)与Ct值的关系为Ct = -3.36lg X 37.11,相关系数R2=0.998.对中国37批太平洋牡蛎(Crassostrea gigas Thunberg)样品进行了定量检测,有6批样品为阳性,并根据标准曲线测定了NLV的含量. 相似文献
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东海原甲藻线粒体细胞色素b(Cytb)基因的定量检测 总被引：3，自引：0，他引：3
建立了检测东海原甲藻线粒体细胞色素b(Cytb)基因mRNA含量的实时荧光定量PCR方法.以甲藻Cytb基因的简并引物扩增得到984 bp长的东海原甲藻Cytb基因片段,经克隆、测序,制备并纯化质粒.以光度法测定质粒浓度并作为标准品.对上述基因片段,利用PRIMER EXPRESS 3.0 设计引物,以梯度稀释的质粒标准品进行定量PCR反应,以SYBR Green I为荧光染料,制作标准曲线,得到基因拷贝数X与Ct值的关系为:Ct=-3.50 lg X+39.35(相关系数r为0.999).通过对不同生长时期的东海原甲藻样品的Cytb基因mRNA含量检测,发现该基因的表达量较稳定,平均值为(45.4±4.7)拷贝/细胞,受生长状态影响不大,可作为实时荧光定量PCR的内参基因. 相似文献
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本文根据GenBank中对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)基因组上的保守序列,采用Taqman-MGB荧光定量PCR方法,设计了一组特异性引物和探针.利用阳性标准模板进行了定量PCR条件的优化研究.结果显示,在101～108拷贝范围内标准曲线的线性关系为R=0.999 4,检测灵敏度达到10拷贝,重复检测的变异系数均小于2％.利用上述建立的方法和条件,测定39份不同来源的对虾样品中IHHNV,检出率为49％.因此所建立的荧光定量PCR具有较高的灵敏度、特异性和重复性,可作为IHHNV快速的定量检测方法. 相似文献
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弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)是近年来国内外学者公认的新食源性致病菌,对全球公共卫生和食品安全造成潜在威胁。本研究根据弗尼斯弧菌的toxS基因分别设计了普通PCR引物和实时荧光PCR引物、探针,建立了用于弗尼斯弧菌快速检测的普通PCR方法和实时荧光PCR方法,对这2种方法的特异性和灵敏度进行比较分析。研究表明,建立的普通PCR方法和实时荧光PCR方法特异性良好,检测灵敏度分别为2 400和24CFU/mL,2种方法的检测灵敏度分别是传统培养方法的10和1 000倍,同时对384份水产品和食品样品进行检测,共检出6株阳性菌株。本研究建立的基于弗尼斯弧菌toxs基因的2种PCR方法特异性均为100%,灵敏度分别为2 400和24CFU/mL,完全满足了弗尼斯弧菌的检测标准,可应用于食品样品中弗尼斯弧菌的检测。 相似文献
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根据包纳米虫（Bonamia sp.）SSU rDNA和派琴虫（Perkinsus sp.）ITS rDNA的保守区序列,设计特异性引物和Taqman MGB探针,建立了同时检测上述两种贝类原虫的双重实时荧光PCR方法.该方法可检测到包纳米虫基因的446拷贝质粒,以及派琴虫基因的171拷贝质粒,具有较高的灵敏度.以10倍系列稀释的包纳米虫阳性标准品质粒和派琴虫阳性标准品质粒为模板,测得该方法的定量标准曲线相关系数分别为0.999和1.000,显示出很好的扩增效率.同时该方法与尼氏单孢子虫（Haplosporidium nelsoni）、沿岸单孢子虫（H.costale）等其他贝类原虫,以及副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）和鮰爱德华氏菌（E.ictaluri）等海水养殖常见致病菌之间无交叉反应,表现出较高的特异性.福建莆田的湄州湾、平海湾、兴化湾等地采集的296份贝类临床样本的检测证明,该方法是一种有效的快速检测鉴定上述2种贝类原虫的方法,具有良好的灵敏度和特异性,可广泛应用于海洋贝类原虫感染情况调查,以及贝类疫病检疫监控等领域. 相似文献
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淋巴囊肿病毒实时定量PCR检测方法的建立和应用 总被引：2，自引：0，他引：2
选取淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus,LCDV)主衣壳蛋白(MCP)基因保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物,通过优化反应条件,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR的检测方法,并进行了敏感性、特异性分析.SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应体系的最佳引物浓度为0.5 μmol/L,方法的检测限为30个病毒拷贝,扩增产物的Tm值为74.5 ℃.该方法对淋巴囊肿病毒有特异性,不能扩增流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、虎纹蛙病毒(TFV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)及真鲷虹彩病毒(RSIV).对12份发病牙鲆鱼样品进行检测,均感染淋巴囊肿病毒;20份无临床症状的牙鲆经检测不含淋巴囊肿病毒.建立的LCDV的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法,具有成本低、特异、灵敏、快速等优点,可用于淋巴囊肿病毒的早期诊断. 相似文献
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PCR法制备地高辛标记探针斑点杂交
检测白斑综合症病毒(WSSV) 总被引：2，自引：0，他引：2
用PCR法成功制备了DIG标记探针，探针长度为547bp，探针的产量为21.6ng/μL。此探针与随机引物合成探针检测样品灵敏度相近。用此探针核酸斑点杂交法检测了54尾中国对虾。结果表明此探针在对白斑综合症病毒的检测、对虾暴发性流行病的诊断等方面具有很高的应用价值。 相似文献
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利用SYBR荧光定量PCR技术，制备用于花鲈（Lateolabrax japonicus）PPARα基因实时荧光定量PCR检测的质粒标准品．通过PCR扩增出目的片断344-bp，纯化后连接至pMDI8-T载体，转化宿主菌E．coli DH5α．通过PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析后抽提重组质粒，测定其拷贝浓度，10倍梯度稀释成标准品模板10^8～10^4 copy／mm^3，进行荧光定量PCR分析．结果显示，循环阈值（Ct）与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系． 相似文献
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基因芯片技术在病原菌检测领域展现出良好的前景,本文依托水产病原菌基因检测芯片的检测体系,以水产常见病原弧菌的hsp60、toxR基因检测探针为研究对象,系统研究不同点样液配方、寡核苷酸探针浓度、荧光标记物质浓度、杂交温度、杂交时长对芯片杂交效果的影响,并进行相应优化。结果表明,杂交温度为60℃、杂交时长为2h、探针浓度为1μmol/L、Cy3标记的随机引物的用量为150pmol时,芯片的经济性、灵敏度、检测效率达到均衡;以0.1mol/L磷酸氢二钠和25%二甲基亚砜混合溶液作为点样液,效果较好。优化后的芯片对4种弧菌的检测没有出现交叉杂交现象,探针特异性达到100%;对溶藻弧菌全基因组DNA检测灵敏度为10fg,高出PCR方法约2个数量级。 相似文献
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参照鱼类病毒性出血性败血症病毒序列,根据PCR引物设计的原则,设计巢式PCR引物,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对如何快速检测鱼类病毒性出血性败血症病的方法进行了较为系统的研究,并对RT-PCR的反应条件进行了优化.结果表明,巢式RT-PCR扩增获得279bp的特异性片断,阴性对照无扩增条带.巢式RT-PCR扩增出的特异性片段经测序分析,结果证实与报道的序列完全一致.该方法最低可检测出0.1pg的鱼类病毒性出血性败血症病毒RNA.初步建立了VHSV的巢式RT-PCR检测方法,该方法灵敏、特异,可为VHSV的检测提供一个快速、有效的手段. 相似文献
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Gene specific primers and DNA probe were designed based on the sequence of 18S rDNA cloned from the red tide alga Thalassiosira rotula. A real-time fluorescent quantitative PCR (RFQ-PCR) method was developed for quantitative detection of T.rotula. The RFQ-PCR assay data showed that the results obtained with the RFQ-PCR quite good agreement with those with the light microscope (LM) counting method, which suggested that the RFQ-PCR could be a useful method for red tide alga detection. 相似文献
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Diagnosis of iridovirus in large yellow croaker by PCR 总被引：1，自引：0，他引：1
A rapid and sensitive PCR-based method for the detection of the large yellow croaker iridovirus(LYCIV) is described,which involves the amplification of a 295 bp fragment of the LYCIV ATPase gene from DNA isolated from naturally infected fish spleen.Sequencing of LYCIV ATPase gene fragment showed it shared 100% nucleotide sequence homology with the corresponding region of the ATPase gene of red sea bream iridovirus(RSIV) and sea bass iridovirus(SBIV),suggesting that LYCIV was homologous with RSIV and SBIV at least in part of the gemone.The specificity and sensitivity of the PCR procedure were tested on the iridovirus-infected fishes,the expected fragment was detected from spleen DNA samples of infected fishes,whereas no fragments were amplified from healthy fish spleen DNA,white spot syndrome baculoviruses(WSBV) DNA and pseudorabies virus(PRV) DNA.Detection limit of this method was 10-7 ng positive plasmid DNA containing target sequence,equal to about 100 virions.In the infected experiment,first positive detection(1/4) appeared at Day 3 post-infection,all fish(4/4) tested positive at Day 7,however obvious symptoms were observed at Day 8,so LYCIV infection could be detected prior to the appearance of obvious symptoms.These results indicate that this PCR method could be used for early,rapid and specific detection of LYCIV infection. 相似文献
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HWANG Jinik PARK So Yun SUH Sung-Suk PARK Mirye LEE Sukchan LEE Taek-Kyun 《海洋学报(英文版)》2016,35(8):44-50
Viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) and marine birnavirus (MABV) are the causative pathogens for some of the most explosive epidemics of emerging viral diseases in many Asian countries, leading to huge economic losses in aquaculture. Rapid molecular detection for surveillance or diagnosis has been a critical component in reducing the prevalence of pathogen infection. The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of DNA is currently one of the most commonly used molecular diagnostic tools, as it is simple, quick, and easy to amplify target DNA under isothermal conditions. In the present study, a novel and highly specific LAMP assay for the sensitive and rapid detection of VHSV and MABV infection in fish was developed. Using a set of synthesized primers matching a specific region of the genome, the efficiency and specificity of the LAMP assay were optimized in terms of the reaction temperature and DNA polymerase concentration, as they are the main determinants of the sensitivity and specificity of the LAMP assay. In particular, we demonstrated that our assay could be applied to efficient detection of VHSV and MABV infection in the wild fish, Paralichthys olivaceus. Our results demonstrate the simplicity and convenience of this method for the detection of viral infection in aquatic organisms. 相似文献