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1.
《中国海洋大学学报(自然科学版)》2016,(11)
本论文利用RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)蛋白磷酸酶1催化亚基β(Protein phosphatase 1catalytic subunit beta isoform,PP1β)基因cDNA序列全长。该基因全长1 214bp,包含一个987bp的开放阅读框,编码328个氨基酸。同源性分析显示,中国对虾PP1β氨基酸序列与不同物种PP1β的相似性高达90%~91%,表现出高度保守性。多序列比对结果显示,不同物种PP1β均含有丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白磷酸酶家族的特征基序GDxHG、GDxVDRG和GNHE。系统进化树分析显示,甲壳动物PP1β聚为一大支,中国对虾PP1β和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)聚为一小支。实时荧光定量PCR分析显示,PP1β在健康的中国对虾各组织中均有不同程度的表达,其中在性腺中表达最高,血细胞次之。白斑症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)注射感染健康中国对虾后,血细胞和性腺中PP1β基因均呈上调表达,并在12h达到峰值,且在血细胞中上调表达更显著。构建了中国对虾PP1β基因原核重组表达载体pET28a-PP1β,转化大肠杆菌后成功诱导表达重组PP1β蛋白(rPP1β),分子量为41kDa。将亲和层析纯化的rPP1β免疫BALB/c小鼠制备抗血清,通过制备中国对虾血细胞滴片,应用间接免疫荧光法检测PP1β在血细胞中的分布情况,结果显示,中国对虾PP1β在血细胞的核区及细胞质内均有分布。本研究结果为进一步解析中国对虾PP1β与WSSV感染的相互关系提供了数据。 相似文献
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白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28单链抗体的酵母表面展示及其抗病毒特性的初步研究 总被引：1，自引：0，他引：1
白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是对虾养殖业中危害最大的病原微生物之一,对对虾养殖业造成了巨大的经济损失,但目前尚无有效防治手段.本研究从WSSV囊膜蛋白VP28免疫的小鼠细胞中分别扩增到重链可变区基因和轻链可变区基因,大小为351 bp和342 bp.两基因序列通过Linker序列连接后,构建到酵母表面载体pYD1中,得到重组质粒pYD1-vp28scfv.将该重组质粒在酿酒酵母EBY100中诱导表达,通过免疫荧光实验发现,重组蛋白VP28scFv在酿酒酵母EBY100表面实现展示.进一步通过结合实验表明该展示蛋白具有WSSV的结合活性.本研究在结合酿酒酵母可作为饲料添加剂的特性基础上,对WSSV囊膜蛋白VP28单链抗体的抗病毒特性进行了应用,从而为WSSV的防治提供了新思路. 相似文献
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通过利用分子生物学手段克隆IHHNV衣壳蛋白基因并构建原核表达载体,筛选抗原特性好的多肽免疫兔以制备高效的特异性IHHNV多克隆抗体,最终建立高效的检测对虾IHHNV的新型双抗夹心ELISA方法.实验结果表明该方法成功表达了对虾病毒IHHNV衣壳蛋白基因的抗原多肽,并制备出了高灵敏性的多克隆抗体.将抗原多肽及多克隆抗体用于ELISA的检测,抗体的效价在1∶12 800以上,最低可检测到1 pg的抗原蛋白,表明已成功建立高效的双抗夹心ELISA方法,对于对虾的海水养殖及IHHNV病毒性疾病的防控具有重要的参考价值. 相似文献
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中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞中一氧化氮合成酶的鉴定及其在白斑综合症病毒感染过程中的变化 总被引：11，自引：0，他引：11
诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)在生物机体免疫，特别在无脊椎动物免疫中的作用近来得到了广泛的关注，由其催化产生的一氧化氯(NO)除具有已知的神经传导、松弛平滑肌等功能外，还具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫等作用。作者通过硝基四氯唑蓝(NBT)法和血细胞形态观察等方法，对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞中存在的诱导型一氧化氮合成酶进行了初步鉴定。在此基础上，通过亚硝酸盐法和L-瓜氨酸法对比，研究了感染白斑综合症病毒(WSSV)后中国明对虾血细胞中一氧化氯合成酶的变化情况。结果显示，中国明对虾在感染WSSV后，iNOS活性在12h内有上升趋势，实验36h后酶活性显著下降，至60h后酶活性降至对照组的一半左右。同时，被脂多糖(LPS)诱导的一氧化氮合成酶活性与对照相比也有显著下降。与此对应的是，核酸探针斑点杂交法检测病毒的结果显示：实验36h后在对虾体内能够检测到白斑综合症病毒。对照组中国明对虾血细胞的iNOS在实验过程中基本保持稳定。这说明WSSV在感染中国明对虾初期可以诱导血细胞产生iNOS，但随着WSSV在中国明对虾体内的大量增殖及其对血细胞的破坏，使得iNOS活性显著降低，对虾也趋于死亡。因此，iNOS能够作为反映对虾在病毒感染过程中健康状况的有效指标。 相似文献
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对白斑症病毒（white spot syndrome virus,WSSV）感染与病毒囊膜完整性关系的探讨,是深入研究切断WSSV感染途径,为该病的预防提供一条新思路、新方法并积累实验依据的重要环节.本实验利用物理低渗方法即用蒸馏水使WSSV的囊膜破碎,破坏了病毒囊膜完整性,并用此病毒做螯虾体内、外感染实验.结果发现,WSSV的囊膜破碎后仍具有感染性;在此基础上,分别用抗WSSV囊膜蛋白的单克隆抗体（4G9）和抗WSSV核衣壳蛋白单克隆抗体（2A3）进行螯虾体内中和实验,结果显示抗WSSV囊膜蛋白的单抗有中和作用,而抗WSSV核衣壳蛋白的单抗无中和作用;将破碎的囊膜从核衣壳上去掉后,用不同浓度的纯核衣壳重复以上体内感染实验,结果其感染性消失,说明囊膜破碎的WSSV引起的感染是由WSSV上的破碎囊膜介导的病毒侵染所致,而不是核衣壳被直接内吞引起的.这些结果提示,WSSV是否引起靶细胞感染主要与病毒囊膜上与病毒侵染有关的功能蛋白有直接关系,只要这些功能蛋白活性不变并且存在的量足以与靶细胞膜结合,即使WSSV囊膜破碎、结构不完整也能引起感染. 相似文献
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中国对虾素在大肠杆菌(Escherichia coli)中的重组表达 总被引：3，自引：0，他引：3
中国对虾素是从中国对虾血细胞中克隆得到的一种抗菌肽。为了进一步研究中国对虾素(CHP)的功能并为制备特异性抗体作准备，采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法，进行了对虾素原核表达的研究。根据从中国对虾血细胞中克隆得到的对虾素基因设计特异性引物扩增中国对虾素成熟肽基因(CHP)，插入原核表达载体pGEX-4T-1中，在E．coli BL21表达融合蛋白GST-CHP．结果表明，不同表达菌株的融合蛋白表达量为30％—34％，同一菌株在诱导5h后能达到最高表达量。利用GST亲和层析纯化融合蛋白，将融合蛋白用凝血酶裂解以得到CHP，其分子量约为5．6kDa，N-端测序结果与期望的成熟对虾肽序列一致。用液体生长抑制方法检测活性，表明重组GST-CHP蛋白及CHP均表现出对大肠杆菌的抑菌活性。 相似文献
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对虾白斑综合症病毒（WSSV）是对虾养殖的主要病害之一,在虾养殖业中造成了严重的损失．本研究从WSSV基因组中克隆到vp41a基因,大小约为900bp,发现该基因编码蛋白VP41A．通过构建重组质粒pET．His一卅J0表达了重组蛋白VP41A,大小约为43kDa．并通过Ni一琼脂糖珠交联下拉实验,在虾血细胞中找到一个能与VP41A相互作用蛋白,质谱分析发现该蛋白为细胞粘连蛋白,说明在WSSV感染宿主细胞的过程中蛋白VP41A可能发挥重要作用．本研究结果推动了WSSV与宿主对虾相互作用的研究,有利于探索病毒复制或转录的关键蛋白,为最终的病毒防治及快诛诊断提供科学依据． 相似文献
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《中国海洋大学学报(自然科学版)》2016,(10)
为研究饲料中添加毕赤酵母表达的翻译控制肿瘤蛋白fortilin对凡纳滨对虾免疫反应和抗白斑综合征病毒(WSSV)感染能力的影响。以酵母表达上清冻干粉和酵母培养物冻干粉2种形式在基础饲料中分别添加100mg/kg的重组fortilin蛋白和空质粒重组蛋白,制成4种实验饲料,以基础饲料作为空白对照,设计5个实验组:基础饲料组(C)、酵母表达上清冻干粉组(P-1)、酵母培养物冻干粉组(P-2)、fortilin酵母上清冻干粉组(F-1)和fortilin酵母培养冻干粉组(F-2)。用5种饲料分别饲喂初始体重(4.87±0.26)g的凡纳滨对虾20d,随后进行WSSV攻毒实验。养殖实验表明,F-1组和F-2组中凡纳滨对虾血淋巴的血细胞数(THC)、呼吸爆发活性(RB)和血清酚氧化酶活性(PO)显著高于C组(P0.05)。F-2组的THC、RB、PO和超氧化物歧化酶(SOD)活性均显著高于P-2组(P0.05)。F-1组的PO和一氧化氮合酶(NOS)活性显著高于P-1组(P0.05)。攻毒实验显示,饲料中添加fortilin蛋白显著降低了凡纳滨对虾的死亡率(P0.05):F-1和F-2组的累计死亡率分别为19.2%和15.4%,P-1和P-2组的累计死亡率分别为56.0%和47.8%,C组累计死亡率为84.6%。研究结果表明,凡纳滨对虾摄食添加重组fortilin蛋白的饲料后,对虾的免疫力和抗WSSV感染的能力显著增强。 相似文献
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对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒衣壳蛋白基因的克隆表达及抗体制备 总被引：2，自引：0，他引：2
本文根据GenBank登录的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的全基因组序列(NC-002190),设计出主要结构蛋白基因的相应引物,从厦门发病的对虾中,提取DNA,以此为模板,利用PCR扩增目的基因.再将目的基因分别与pGEX-6p1载体和pET-28a载体连接,构建重组表达载体pGEX-Ⅳ、pET-Ⅳ,重组子经酶切和测序鉴定后导入表达型大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测,大小约为62KDa和41KDa,与预测大小一致.将pET-Ⅳ表达重组蛋白经纯化,免疫小鼠,Western免疫印迹反应结果表明其抗体均可与pGEX-Ⅳ和pET-Ⅳ表达的蛋白发生特异性反应.本研究的结果为对虾IHHNV的快速检测及其免疫提供了研究基础. 相似文献
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White spot syndrome virus （WSSV） is one of the major shrimp pathogens causing large economic losses to shrimp farming. In an attempt to identify the envelope proteins involved in the virus infection, purified WSSV virions were mixed with three antisera against WSSV envelope proteins （VP39, VP124 and VP187 ）, individually. And then they were injected intramuscularly into crayfish （Procambarus clarkii） to conduct in vivo neutralization assays. The results showed that for groups injected with virions only and groups injected with the mixture of virions and antiserum against VP124, the crayfish mortalities were 100% and 60% on the 8th day postinfection, individually. The virus infection could be delayed or neutralized by antibody against the envelope protein VP124. Quantitative PCR was used to further investigate the influence of three antisera described above on the virus infection. The results showed that the antiserum against VP124 could restrain the propagation of WSSV in crayfish. All of the results suggested that the viral envelope protein VP124 played a role in WSSV infection. 相似文献
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白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是对虾的最主要病毒病原之一,给对虾养殖造成了巨大的经济损失。WSSV分别与三种该病毒膜蛋白VP39,VP124和VP187的特异性抗血清在体外作用后,再注射到螯虾体内,进行中和试验。结果显示,注射同或未同VP124抗血清作用的WSSV,8 d后螯虾的死亡率分别是100%和60%,WSSV的感染能够被抗VP124抗体中和。进一步利用定量PCR分析上述三种特异性抗血清对病毒感染的影响,结果显示,VP124抗血清可抑制WSSV在螯虾体内的增殖。所有结果表明,VP124在病毒的感染中起作用。 相似文献
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白斑综合征(white spot syndrome,WSS)的爆发已给虾类养殖业造成了严重经济损失,寻找能够指示虾类群体抗白斑病能力的指标对虾类养殖业具有重要意义。本研究以脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda Holthuis)为实验材料,以人工注射白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)攻毒后稳定存活的脊尾白虾作为WSSV耐受群体(命名为Rm),以注射PBS的虾作为对照群体(命名为Vm),分析比较了Rm群体和Vm群体的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性差异以探讨筛选对虾抗病免疫指标的可行性。Rm群体的ACP和AKP活性均显著低于Vm群体(P0.05),而两群体在SOD活性上无显著差异。为进一步检验WSSV耐受群体是否比未经历过病毒感染的虾具有更高的抗WSSV的能力,作者以实验室养殖过程中经过WSSV自然感染后存活的脊尾白虾作为抗性群体(命名为Rn),以未经历过WSSV感染的脊尾白虾作为普通群体(Vn),进行WSSV人工注射攻毒,观察它们在WSSV感染后的存活率,结果显示Rn群体攻毒后存活率为33.2%,显著高于Vn群体的存活率15.1%(P0.05),说明ACP和AKP有可能作为虾类抗WSSV能力的评价指标。 相似文献
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凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)感染白斑症病毒(WSSV)后大颗粒血细胞的变化 总被引：6，自引：0，他引：6
采用抗凡纳滨对虾大颗粒细胞的单克隆抗体，应用免疫细胞化学方法，分析了凡纳滨对虾人工感染白斑症病毒(WSSV)后血细胞中大颗粒细胞的变化。研究表明，凡纳滨对虾感染WSSV后，大颗粒细胞的细胞质较正常细胞的多；从WSSV感染凡纳滨对虾的第1天至第3天，大颗粒细胞的数量增加幅度较大。同时，大颗粒细胞占血细胞总数的比例也增加较大：第1天为15．2％，第2天为18％，第3天增大到45．9％，而后大颗粒细胞的比例稍有下降，到第8天下降到43．3％，但仍明显高于对照组(健康虾的大颗粒细胞比例为15．2％)。 相似文献
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采用5种不同饵料投喂斑节对虾幼虾，研究各饵料对幼虾的体长、体重及成活率的影响，实验周期为20天；然后用投喂攻毒的方法分别感染WSSV，观察不同饵料对幼虾WSSV敏感性的影响。实验周期为12天。结果表明，投喂卤虫无节幼体组的幼虾，其体长、体重增长明显优于其它各组（P〈0．01），随后依次为贝肉组、鱼肉组、人工配合饲料组、虾片组。不同饵料对幼虾WSSV敏感性的影响也有差异：投喂感染WSSV后，卤虫组和鱼肉组成活率最高，明显高于贝肉组、人工配合饲料组和虾片组（P〈0．01）。PCR检测表明，感染后全部幼虾个体为病毒阳性。 相似文献
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对虾WSSV人工感染螯虾及其检测 总被引：13，自引：0，他引：13
用对虾白斑综合症病毒（WSSV）人工感染淡水克氏原螯虾（Procambarus clarkii),感染组螯虾3-6d内全部死亡,核酸探针点杂交两次检测感染螯虾的鳃、胃、血淋巴,阳性检出率分别为92%（92%）,89%（86%）,81%（75%）,对照为11%（3%）,3%（5%）,0（0）;光镜下可观察到感染螯虾的胃、鳃组织的靶细胞核肿大,嗜酸性着染,电镜下病变组织细胞核可见形态大小与WSSV一致的病毒粒子;病毒核酸原位杂交两次检测感染螯虾的胃、鳃、阳性检出率均为100%,对照阳性检出率均为0。结果表明：对虾WSSV可感染淡水克氏原螯虾,病毒核酸原位杂交是一种敏感特异的病毒检测方法。 相似文献
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Penaeidin from Chinese shrimp (Fenneropenaeus chinensis) has proved to be one of the most important antimicrobial peptides in the bodies of animals. The relative quantitative real-time PCR method is developed to study through time, the mRNA expression profile of penaeidin in the muscle and haemoeyte tissue of Chinese shrimp infected with vibrio (Vibrio anguillarum) and WSSV (white spot syndrome virus). Research results showed that the same pathogens infection experiments produced similar gene expression profile in different tissues while different expression profiles appeared in the same tissues infected by different exterior pathogens. In vibrio infection experiments, a “U” like expression profile resulted. Expression levels of ponaeidin increased and surpassed the non-stimulated level, indicating that penaeidin from Chinese shrimp has noticeable antimierobial activities. In WSSV infection experiments, the expression profile appeared as an inverse ““““U““““ with the expression ofpenaeidin gradually decreasing to below baseline level after 24 h.The expression of antimierobial peptides gene in mRNA level in response to virus infection in shrimp showed that international mechanisms ofvirns to haemoeytes and microbial to haemoeytes are completely different. Decline of ponaeidins expression levels may be due to haemoeytes being destroyed by WSSV or that the virus can inhibit the expression ofponaeidins by yet undiscovered modes. The expression profiles of penaeidin in response to exterior pathogen and the difference of expression profiles between vibrio and WSSV infection provided some clues to further understanding the complex innate immune mechanism in shrimp. 相似文献