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1.
病毒在海洋生态系统的物质循环和能流中起着重要作用,对其进行有效定量是研究其数量变动和生态功能的前提。现行的海洋沉积物病毒定量主要采用荧光染色计数法,但对技术流程中一些处理方法的定量效能尚待验证。本研究利用不同类型海洋沉积物对荧光计数法进行了效能评估和条件优化。结果表明:将沉积物采样后染色封片直接计数或-20°C保存为最佳,保存3个月后未见丰度降低。而不同类型的沉积物经液氮闪冻后于-80°C冷冻保存后的定量效能不同:沙质沉积物保存1个月后病毒丰度下降1个数量级;泥沙质沉积物保存1个月后丰度降低了约27%,2个月后则下降了60%。对焦磷酸钠最优终浓度实验结果显示,使用3mmol/L终浓度获得的病毒计数定量效能优于目前普遍使用的5mmol/L终浓度。水浴超声分离在常温下的定量效果更优,在水浴中添加冰块导致获取的沙质沉积物中的病毒丰度下降约37%。研究发现:处理中用稀释替代离心不仅可降低沉积物颗粒的干扰,而且定量效能更高;离心处理获取的沙质和泥沙质沉积物中的病毒丰度较稀释处理低约40%。对海洋沉积物中原核生物的定量效能与病毒有相似的结果。据此,本文提出了改进的沉积物病毒荧光计数法的操作流程。 相似文献
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本文根据GenBank中对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)基因组上的保守序列,采用Taqman-MGB荧光定量PCR方法,设计了一组特异性引物和探针.利用阳性标准模板进行了定量PCR条件的优化研究.结果显示,在101～108拷贝范围内标准曲线的线性关系为R=0.999 4,检测灵敏度达到10拷贝,重复检测的变异系数均小于2％.利用上述建立的方法和条件,测定39份不同来源的对虾样品中IHHNV,检出率为49％.因此所建立的荧光定量PCR具有较高的灵敏度、特异性和重复性,可作为IHHNV快速的定量检测方法. 相似文献
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运用Epsilon3系列小型能量色散X射线荧光光谱仪,选取水系沉积物、海洋沉积物等标准物质31个,采用压片法制样,建立了该仪器对海洋沉积物中34种元素定量测试的分析方法,该方法检出限低,精密度高,准确性好。在海上调查期间运用该仪器与方法,对深海沉积物样品进行了现场测试,调查船上的测定值与陆上实验室内的测定值基本一致,两者平均相对偏差基本小于10%,结果表明运用该分析方法,Epsilon3系列小型能量色散X射线荧光光谱仪能快速、准确测定沉积物中多种元素,为及时判断现场资源分布情况提供依据,减少取样的盲目性,这将为我国海洋地质调查工作提供新的技术支持。 相似文献
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锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 总被引：2，自引：0，他引：2
研究建立并完善了Taqman实时荧光定量PCR检测锦鲤疱疹病毒（KHV）的方法。首先通过选取KHV病毒TK基因的保守序列（GenBank AB182940）,利用PRIMER EXPRESS 2.0设计引物和探针。其中Taqman探针的5’端标记FAM,3’端标记TAMRA。然后利用梯度稀释的阳性样品克隆质粒进行定量PCR反应,制作标准曲线,得到病毒拷贝数与Ct值的关系为：Ct=-3.45 lgX＋42.73（相关系数R2=0.989）。通过试验检测得到实时荧光定量PCR对KHV的灵敏度为32个病毒核酸拷贝数,同时,设计的引物和探针对于鱼类细胞系和其它鱼类病毒没有扩增反应,表现出较好的特异性。实验结果表明,实时荧光定量PCR检测KHV的方法,具有特异性好、灵敏度高的特点,可以缩短检测时间,提高检测速度,非常适合口岸进出口检验检疫的要求。 相似文献
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结合双重PCR(Duplex PCR,dPCR)和扩增产物熔点的测定,建立了一种定量分析近缘物种混合样品中各物种相对含量的新方法。即针对混合样品中2种物种的DNA序列,各自设计高特异性引物,使2种物种的DNA同时进行PCR扩增而互不干扰,且扩增产物的熔点有足够的差别(1℃);然后进行PCR扩增并测得不同温度下PCR产物同荧光染料结合后的荧光值;该荧光值对温度进行微分所得微分曲线上会产生2个峰(在两物种各自PCR产物熔点温度处),根据这2个峰的峰高比值同其相对含量的关系,即可完成对各物种含量的定量分析。本研究以长鳍和黄鳍金枪鱼的混合样品为例,对此方法的可行性进行了验证。结果表明,2种成分的含量比与对应峰值比之间线性关系良好;当混合样品中含有10%以上长鳍金枪鱼或5%以上黄鳍金枪鱼时,能够进行较准确的定量检测,证明了本方法切实可行。这一新方法解决了在混合样品中难以准确定量物种的难题,在食品安全和基因诊断领域有广泛的应用前景。 相似文献
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东海原甲藻线粒体细胞色素b(Cytb)基因的定量检测 总被引：3，自引：0，他引：3
建立了检测东海原甲藻线粒体细胞色素b(Cytb)基因mRNA含量的实时荧光定量PCR方法.以甲藻Cytb基因的简并引物扩增得到984 bp长的东海原甲藻Cytb基因片段,经克隆、测序,制备并纯化质粒.以光度法测定质粒浓度并作为标准品.对上述基因片段,利用PRIMER EXPRESS 3.0 设计引物,以梯度稀释的质粒标准品进行定量PCR反应,以SYBR Green I为荧光染料,制作标准曲线,得到基因拷贝数X与Ct值的关系为:Ct=-3.50 lg X+39.35(相关系数r为0.999).通过对不同生长时期的东海原甲藻样品的Cytb基因mRNA含量检测,发现该基因的表达量较稳定,平均值为(45.4±4.7)拷贝/细胞,受生长状态影响不大,可作为实时荧光定量PCR的内参基因. 相似文献
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饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)非特异免疫基因表达量和抗病力的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
采用实时荧光定量PCR方法,进行肠道复合益生菌对凡纳滨对虾相关免疫基因表达量的研究。通过感染实验,分析饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾病毒感染能力的影响。结果表明,Real-time PCR揭示在投喂期间饲料中添加芽孢杆菌/溶藻弧菌组的对虾血淋巴细胞中的proPO、SOD和LZM的相对表达量均显著高于对照组(P<0.05);感染WSSV后,对芽孢杆菌/溶藻弧菌组凡纳滨对虾血淋巴7个采样时间点的proPO、SOD、LZM的表达进行Real-time PCR分析,检测表明WSSV刺激24h后,对虾血淋巴中的proPO、SOD和LZM的表达呈现显著性上调,且分别在48h、96h、96h达到最大值。累积死亡率结果证实饲料中添加益生菌均可提高其对虾抗WSSV感染的能力,尤其以坚强芽孢杆菌活菌与溶藻弧菌活菌配合使用效果更佳。 相似文献
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利用简并引物PCR以及cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得了总长度为1197bp的翡翠贻贝Perna viridis CYP4基因cDNA序列.根据所获得的翡翠贻贝cDNA序列设计定量PCR引物,利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术测定了CYP4基因在野生翡翠贻贝消化腺、足和性腺中的表达水平.此外,本研究还应用实时荧光定量PCR技术对经过Aroclor1254暴露处理对翡翠贻贝性腺中CYP4表达水平的影响进行了定量测定.研究结果表明,CYP4基因在野生翡翠贻贝消化腺、足和性腺中均有表达,且其表达水平具有组织差异和性别差异;Aroclor1254暴露处理对翡翠贻贝性腺CYP4基因的表达水平有明显的诱导作用,并且这种诱导作用有明显的时间和剂量效应.本研究为CYP4基因作为生物大分子标记物在环境监测领域的应用提供了分子生物学水平的支持. 相似文献
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内蒙古河套地区陈普海子湖泊沉积物粒度特征及其环境意义 总被引：1，自引：0，他引：1
《海洋地质与第四纪地质》2014,(5)
对河套地区陈普海子湖泊及其流域不同类型表层沉积物的粒度特征进行了分析,并结合放射性同位素210Pb测年,探讨了湖泊的沉积演变过程。通过主成分分析,对沉积物剖面粒度不同粒级组分含量进行了研究,分析了湖泊沉积物的物质来源,得到两个主控因子F1和F2,它们控制了湖泊沉积物近98.68%的粒度变化特征。研究表明,F1代表了以6.18μm为众数粒径的次总体,主要受流水作用控制;而F2为以42.75μm为众数粒径的次总体,主要来源于地表风沙作用。通过粒径-标准偏差方法,提取了湖泊沉积物中不同时期的环境敏感粒度组分,结果表明:在1996AD之前,流水作用所携带的细颗粒(14.1μm)决定了沉积物的粒级特征,在1960—1985AD期间表现出风沙活动强烈;1996AD以来,由于人类开展了大规模的沙荒土地开垦,流沙活动强烈,流域风沙活动所携带的粗颗粒(14.1~224.35μm)控制了沉积物的粒度组成。 相似文献
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冷扩散法提取沉积物中的酸可溶硫化物及其在中国边缘海区的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为了快速而有效地对中国边缘海区沉积物中的酸可溶硫化物(AVS)进行研究,冷扩散法被引入。用冷扩散法提取不同体积硫化物溶液中的AVS,所得到的AVS含量与所加溶液体积的相关性较好,说明此方法具有较好的提取效果。在中国边缘海不同典型海域的浅表层沉积物中,利用冷扩散法对AVS进行了分析:胶州湾李村河口AVS的浓度在0.4~120.1μmol/g之间;南黄海西北部陆架在0~11.1μmol/g之间;南海北部陆坡一柱状样沉积物中多数样品<1μmol/g。结果显示不同典型海域沉积物中AVS的分布差别较大,符合不同环境沉积物中AVS含量的一般规律。因此冷扩散法作为一种有效的AVS提取方法,值得在研究中使用与推广。 相似文献
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根据包纳米虫（Bonamia sp.）SSU rDNA和派琴虫（Perkinsus sp.）ITS rDNA的保守区序列,设计特异性引物和Taqman MGB探针,建立了同时检测上述两种贝类原虫的双重实时荧光PCR方法.该方法可检测到包纳米虫基因的446拷贝质粒,以及派琴虫基因的171拷贝质粒,具有较高的灵敏度.以10倍系列稀释的包纳米虫阳性标准品质粒和派琴虫阳性标准品质粒为模板,测得该方法的定量标准曲线相关系数分别为0.999和1.000,显示出很好的扩增效率.同时该方法与尼氏单孢子虫（Haplosporidium nelsoni）、沿岸单孢子虫（H.costale）等其他贝类原虫,以及副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）和鮰爱德华氏菌（E.ictaluri）等海水养殖常见致病菌之间无交叉反应,表现出较高的特异性.福建莆田的湄州湾、平海湾、兴化湾等地采集的296份贝类临床样本的检测证明,该方法是一种有效的快速检测鉴定上述2种贝类原虫的方法,具有良好的灵敏度和特异性,可广泛应用于海洋贝类原虫感染情况调查,以及贝类疫病检疫监控等领域. 相似文献
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This study investigated differences in the community structure and environmental responses of the bacterial community in sediments of the Bohai Sea.Illumina high-throughput sequencing technology and real-time PCR were used to assay the bacterial 16S rRNA genes in the surface sediments of 13 sampling stations in the Bohai Sea.The results showed that sediments at the majority of the 13 sampling stations were contaminated by heavy metal mercury.The main phyla of bacteria recorded included Proteobacteria(52.92%),Bacteroidetes(11.76%),Planctomycetes(7.39%),Acidobacteria(6.53%)and Chloroflexi(4.97%).The genus with the highest relative abundance was Desulfobulbus(4.99%),which was the dominant genus at most sampling stations,followed by Lutimonas and Halioglobus.The main factors influencing bacterial community structure were total organic carbon,followed by depth and total phosphorus.The content of lead,cadmium,chromium,copper and zinc had a consistent effect on community structure.Arsenic showed a negative correlation with bacterial community structure in most samples,while the impact of mercury on community structure was not significant.The bacterial community in sediment samples from the Bohai Sea was rich in diversity and displayed an increase in diversity from high to low latitudes.The data indicated that the Bohai Sea had abundant microbial resources and was rich in bacteria with the potential to metabolize many types of pollutants. 相似文献
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利用SYBR荧光定量PCR技术，制备用于花鲈（Lateolabrax japonicus）PPARα基因实时荧光定量PCR检测的质粒标准品．通过PCR扩增出目的片断344-bp，纯化后连接至pMDI8-T载体，转化宿主菌E．coli DH5α．通过PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析后抽提重组质粒，测定其拷贝浓度，10倍梯度稀释成标准品模板10^8～10^4 copy／mm^3，进行荧光定量PCR分析．结果显示，循环阈值（Ct）与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系． 相似文献
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Gene specific primers and DNA probe were designed based on the sequence of 18S rDNA cloned from the red tide alga Thalassiosira rotula. A real-time fluorescent quantitative PCR (RFQ-PCR) method was developed for quantitative detection of T.rotula. The RFQ-PCR assay data showed that the results obtained with the RFQ-PCR quite good agreement with those with the light microscope (LM) counting method, which suggested that the RFQ-PCR could be a useful method for red tide alga detection. 相似文献
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东海表层沉积物中氨氧化微生物群落的空间分布和季节性变化 总被引：2，自引：0，他引：2
Ammonia oxidation plays a significant role in the nitrogen cycle in marine sediments. Seasonal and spatial distribution of ammonia-oxidizing archaea(AOA) and betaproteobacteria(β-AOB) in surface sediments from the East China Sea(ECS) were investigated using ammonia monooxygenase α subunit(amo A) gene. In order to characterize the community of AOA and β-AOB, real-time quantitative polymerase chain reaction(q PCR) was carried out in this study, along with environmental parameters. The abundance of β-AOB amo A gene(2.17×106–4.54×107 copy numbers per gram wet weight sediment) was always greater than that of AOA amo A gene(2.18×105–9.89×106 copy numbers per gram wet weight sediment) in all sampling stations. The q PCR results were correlated with environmental parameters. AOA amo A gene copy numbers in April were positively related to temperature and nitrite concentration(p0.05). β-AOB amo A gene copy numbers in August correlated negatively with salinity(p0.01), and correlated positively with ammonium concentration(p0.05). With the increase of salinity, the amo A gene copy ratio of AOB to AOA had a tendency to decrease, which suggested β-AOB dominated in the area of high level ammonium and AOA preferred high salinity area. 相似文献
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Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ ｂｙ ｒｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲTXＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＨｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓｉｎｓｈｅｌｌｆｉｓｈｂｙｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒ... 相似文献
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湛江湾沉积物中反硝化和厌氧氨氧化细菌的丰度、多样性及分布特征 总被引：3，自引：0，他引：3
采用实时荧光定量PCR、高通量测序等方法对湛江湾沉积物中四个月份的反硝化细菌与厌氧氨氧化细菌的多样性和丰度进行了分析。结果表明:湛江湾沉积物中反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌丰度在四个月份的变化和空间分布趋势为:nirS型反硝化细菌在二月份最高,四月份最低,且其平均丰度有从湛江湾湾内向湾口附近呈现先升高再降低的趋势;nirK型反硝化细菌丰度在九月份最高,十一月份最低;nosZ型反硝化细菌在四月份最高,其余月份变化不大;厌氧氨氧化细菌丰度在九月份最高,二月份最低。通过相关性分析结果表明,亚硝酸盐、铵盐等共同调控着湛江湾沉积物中反硝化和厌氧氨氧化细菌丰度变化。系统发育分析表明:湛江湾中存在着一些广泛分布的反硝化细菌,但也生活着一些新奇的nirK型和nosZ型反硝化细菌。对于厌氧氨氧化细菌而言,其主要属于浮霉菌门及Candidatus Scalindua属,具有较高的耐盐性,另外湛江湾海区的厌氧氨氧化细菌也生活着一类在其他地方没有的新分支。典范对应分析分析结果表明:硝酸盐显著影响湛江湾反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌的群落结构。湛江湾沉积物中反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌存在特殊的竞争与共存的关系,且由亚硝酸盐、硝酸盐、pH等多种环境因子共同驱动。 相似文献