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1.
泛素结合酶(UbcE2)是蛋白泛素化过程中所必需的酶,在泛素转移和底物的特异性识别方面发挥着重要的作用。本实验利用RACE技术克隆获得了全长为993bp的松江鲈泛素结合酶E2-D2基因cDNA序列(命名为TfUbcE2-D2),其开放阅读框为444bp,编码147个氨基酸。通过SMART预测得知,TfUbcE2-D2含有一个UBCc结构域。同源比对结果表明该基因与其他物种的同源性为92.31%。实时荧光定量PCR显示,TfUbcE2-D2广泛表达于松江鲈各组织,在肾脏中的相对表达量最高,其次为鳃。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后,TfUbcE2-D2在血液、脾脏、肝脏和鳃中表达均上调,其中,脾脏和鳃中的表达量上调约40倍。由以上实验结果推测,TfUbcE2-D2可能参与松江鲈的先天免疫防御。 相似文献
2.
CC趋化因子受体3（CCR3）是CC型趋化因子的受体,属于G蛋白耦联受体（GPCRs）家族成员,与过敏等多种炎性疾病密切相关。为探讨香鱼CCR3（PaCCR3）在响应鳗弧菌感染时的表达变化,从转录组测序数据中获得了PaCCR3基因全长cDNA序列。序列分析表明,PaCCR3具有7次跨膜结构,与胡瓜鱼CCR3氨基酸序列同源性最高（84.6%）。系统进化树分析表明,哺乳类、两栖类和鱼类CCR3单独成簇,鱼类CCR3形成一个大簇;PaCCR3与胡瓜鱼CCR3进化相关性最高。实时荧光定量PCR结果显示,PaCCR3基因mRNA在单核/巨噬细胞（MO/MФ）中表达量最高;鳗弧菌感染后肝、脾和头肾中PaCCR3基因mRNA表达量显著上调;且香鱼MO/MФ经鳗弧菌体外刺激后,PaCCR3基因mRNA的表达量显著上调。Western blot分析表明经鳗弧菌体外刺激后,香鱼MO/MФ中PaCCR3蛋白的表达量也显著增加。综上,PaCCR3基因mRNA及其编码蛋白响应于病原体感染而被诱导表达。研究结果首次揭示了香鱼CCR3基因mRNA及蛋白的表达响应于鳗弧菌侵染,它可能通过介导MO/MФ的功能活性参与免疫应答,可为深入探究鱼类CCR3的功能及作用机制提供新的切入点。 相似文献
3.
采用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)Ⅰ型干扰素基因全长cDNA序列及其基因组序列,并利用荧光定量PCR技术研究了该基因在大黄鱼不同组织中的表达谱,以及副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、LPS、polyI:C刺激后大黄鱼脾脏、肝脏和头肾组织中该基因在转录水平的表达变化。结果表明,大黄鱼Ⅰ型IFN基因全长cDNA为878bp,开放阅读框558bp,编码185个氨基酸。推测的大黄鱼Ⅰ型IFN氨基酸序列N端含有20个氨基酸的信号肽,其后包含一个保守的IFabd结构域。大黄鱼Ⅰ型IFN基因包含5个外显子,4个内含子,在大多数组织和细胞中都有表达,其中在血细胞中表达量最高,肌肉中表达量最低。PolyI:C刺激可诱导大黄鱼Ⅰ型干扰素基因在脾脏、头肾和肝脏中的表达量显著上调;LPS刺激可诱导大黄鱼Ⅰ型干扰素基因在脾脏和肝脏中的表达量显著上调;灭活的副溶血弧菌可诱导大黄鱼Ⅰ型干扰素基因在头肾和肝脏中的表达量显著上调。 相似文献
4.
从本研究前期构建的短蛸(Octopus ocellatus)cDNA文库中克隆得到过氧化物还原酶(OoPrx-4)基因的cDNA全长,该基因cDNA全长934bp,包括5′非编码区(UTR)19bp,3′UTR177bp,开放阅读框(ORF)738bp,共编码245个氨基酸,理论等电点为6.65,预测分子量27.1kDa。采用实时荧光定量PCR法分析了OoPrx-4基因在短蛸各组织及鳗弧菌胁迫下的表达规律,结果表明,OoPrx-4在短蛸血细胞、肌肉、系统心脏、鳃、胃、肾囊、性腺、外套膜和肝胰腺等检测组织中都有表达,其中在肝胰腺的表达量最高。经鳗弧菌刺激后,Prx-4在血细胞中的表达量分别在6h和48h出现了两次明显上调。Prx-4作为抗氧化酶可能在减少机体因抵御鳗弧菌胁迫所产生的过氧化物方面发挥重要的作用。 相似文献
5.
本研究从前期构建的短蛸cDNA文库中克隆获得了一个短蛸(Octopus ocellatus)酪氨酸蛋白激酶(OoBtk)基因的cDNA全长,其cDNA全长1191 bp,包括5’非编码区(UTR)259 bp,3’UTR 227 bp,开放阅读框(ORF)705 bp,编码234个氨基酸,预测理论等电点为8.50,分子量为27.7 kD。运用实时荧光定量PCR法分析了OoBtk在健康短蛸不同组织及鳗弧菌、藤黄微球菌刺激后短蛸血细胞中的表达规律,结果表明：OoBtk在健康短蛸肌肉、外套膜、鳃、鳃心、系统心脏、肝胰脏、肾囊、胃、性腺和血细胞等各检测组织中均有表达,其中在肝胰脏的表达量最高;短蛸经鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后,OoBtk在血细胞中的表达量呈现出了明显的被诱导表达趋势,在鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后6 h后表达即增强,并分别在鳗弧菌刺激后48 h和藤黄微球菌刺激后12 h达到最高。OoBtk参与短蛸对于鳗弧菌和藤黄微球菌刺激的应答过程。 相似文献
6.
肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)是TNF 超家族成员之一, 在动物机体抵 抗细菌和病毒入侵时发挥重要作用。本研究基于香鱼(Plecoglossus altivelis)单核/巨噬细胞转录组数 据库, 获得了香鱼TNF-α 基因(PaTNF-α)全长cDNA 序列。PaTNF-α 由1932 个核苷酸组成, 包含一 个大的开放阅读框, 编码235 个氨基酸, 预测分子量为26.4 kDa.氨基酸序列多重比对分析表明, PaTNF-α 具有TNF 超家族的特征序列、1 个TACE 酶切位点和1 个保守的二硫键, 与虹鳟 (Oncorhynchus mykiss)TNF-α 同源性最高, 为53.4%; 系统进化树分析表明, 鱼类TNF-α 形成一个大 簇, PaTNF-α 与虹鳟TNF-α 进化相关性最高。实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR) 结果显示, PaTNF-α mRNA 在头肾中表达量最高; 鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后香鱼肝、脾、头 肾和外周血细胞中PaTNF-α mRNA 表达量显著上调; 香鱼单核/巨噬细胞经鳗弧菌、LPS 和poly(I: C) 处理后, PaTNF-α mRNA 表达量显著上调。原核表达了PaTNF-α 成熟肽, 并制备了抗血清。Western blot 分析表明, 鳗弧菌感染后香鱼血清和单核/巨噬细胞上清中的PaTNF-α 表达量含量也显著增加。 综上, 香鱼TNF-α mRNA 及蛋白的表达与病原体感染密切相关, 为深入研究鱼类TNF-α 的生物学功 能及其在病原体感染中的作用机制提供理论基础。 相似文献
7.
泥蚶(Tegillarca granosa)血红蛋白基因(Tg-HbIIA)克隆、分析及免疫表达研究 总被引：1，自引：0，他引：1
通过已构建的泥蚶血液cDNA文库,克隆得到泥蚶Tg-HbIIA基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学、组织表达及免疫相关分析。结果表明,泥蚶Tg-HbIIA cDNA全长731bp,包含63bp5′非编码区(5′-UTR),246bp3′非编码区(3′-UTR),开放阅读框450bp,编码150个氨基酸;其氨基酸序列与毛蚶(Scapharca kagoshimensis)和不等壳毛蚶(Scapharca inaequivalvis)的序列有较高的同源性,分别达到89%和88%;对其结构预测显示该蛋白具有血红蛋白功能域,含有10个潜在血红素结合位点。qRT-PCR检测结果显示:泥蚶不同组织部位中,Tg-HbIIA mRNA在血液表达量最大,其次为外套膜和鳃,表达量最低的是肝胰脏;在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticu)、脂多糖、肽聚糖刺激后,泥蚶血液Tg-HbIIA mRNA表达量显著上调,表明Tg-HbIIA在贝类抗菌免疫防御中可能起重要作用,而Tg-HbIIA对不同致病因子免疫反应的灵敏度和表达时序存在一定差异。 相似文献
8.
Imd免疫信号通路在无脊椎动物抗革兰氏阴性菌方面起到十分重要的作用。在已知中国明对虾Imd通路下游核转录因子Relish基因全长的情况下,利用同源克隆方法获得了Imd通路上游基因Imd的cDNA序列,命名为FcImd,该基因全长783bp,5’非编码区45bp,3’非编码区255bp,开放阅读框483bp,编码160个氨基酸,包括一个位于C端的死亡结构域。同源性分析表明,FcImd基因氨基酸序列与其他甲壳动物的氨基酸序列高度保守,与凡纳滨对虾和日本囊对虾的同源性分别为99%和88%。于鳗弧菌感染后的1,3,6,12,24,48,96,144h记录实验组和对照组的累积死亡率,并分别取血淋巴用于检测中国明对虾Imd及Relish基因在不同时间点的表达量变化情况。结果显示:鳗弧菌感染后,实验组Imd和Relish表达量均显著高于对照组(P0.05),其中Imd表达量呈先升高后降低趋势,Relish表达量在1h时达到最高,然后呈逐渐降低趋势。中国明对虾感染鳗弧菌后Imd和Relish基因呈不同步上调表达,说明Imd和Relish基因的表达与弧菌刺激密切相关,提示Imd和Relish基因参与了对虾抗菌反应的Imd信号转导通路。 相似文献
9.
脂多糖诱导的肿瘤坏死因子α(LITAF)是一种重要的转录因子,在调节LPS诱导炎症因子TNF-α的表达过程中发挥重要作用。采用表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)结合cDNA末端快速克隆技术(rapid amplification of cDNA Ends,RACE),获得了菲律宾蛤仔LITAF基因cDNA全长(VpLITAF),并利用实时荧光定量PCR技术研究VpLITAF的组织分布以及鳗弧菌、藤黄微球菌刺激下的时序表达特征。VpLITAF基因序列包含393bp的开放阅读框,编码130个氨基酸,预测分子量为14.39kD,理论等电点7.47。序列分析表明,VpLITAF具有高度保守的LITAF结构域,与其它贝类LITAF具有高度同源性,并在系统进化树中与海洋软体动物LITAF聚为一簇。VpLITAF基因主要表达于蛤仔肝胰腺,肌肉中的表达量则相对较低。鳗弧菌和藤黄微球菌刺激在某些时段可显著诱导VpLITAF基因的表达水平,最高可达对照组表达量的3.5倍,且鳗弧菌对VpLITAF基因表达的诱导作用明显强于藤黄微球菌。以上结果表明,VpLITAF在菲律宾蛤仔的固有免疫反应中发挥着重要作用。 相似文献
10.
实验采用末端快速扩增(RACE)技术从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选得到了免疫球蛋白轻链IgL的全长cD-NA片段。该序列包含47 bp的5′末端非编码区(5′UTR),738 bp的开放阅读框(ORF)和202 bp 3′UTR,整个开放阅读框编码246个氨基酸。系统发生分析表明大菱鲆IgL基因与五条鰤的IgL基因起源关系最近。RT-PCR分析表明,大菱鲆IgL基因只在正常脾脏、肾脏和头肾组织中表达;IgL在大菱鲆胚胎发育细胞期就已开始表达,在大菱鲆胚胎尾芽期和体节期表达持续增强;在鳗弧菌感染大菱鲆脾脏和头肾早期均检测到IgL基因强烈表达,后期表达逐渐减弱;大菱鲆胚胎细胞(TEC)在用鳗弧菌感染48h后,IgL开始表达。这些结果均表明IgL基因在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。 相似文献
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应用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD4和CD4-2基因,并分析了它们在健康鱼不同组织的表达分布及免疫刺激物诱导后的表达变化。CD4基因c DNA序列全长2216bp,包含180bp的5′UTR(untranslated regions)、605bp的3′UTR和1431bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码476个氨基酸;红笛鲷CD4-2基因c DNA序列全长为1520bp,包含62bp的5′UTR、525bp的3′UTR和933bp的ORF,编码310个氨基酸。CD4分子由信号肽、4个免疫球蛋白样结构域(D1—D4)构成的胞外区、跨膜区和胞浆区组成,CD4-2分子由信号肽、2个免疫球蛋白样结构域(D1—D2)构成的胞外区、跨膜区和胞浆区组成。荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR,q PCR)分析显示红笛鲷CD4和CD4-2基因在健康鱼的胸腺中表达量最高,其次是中肾、鳃、皮肤、脾、头肾和肠。红笛鲷头肾淋巴细胞体外经脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)刺激12h后,CD4和CD4-2表达量显著上调(P0.05)。哈维氏弧菌疫苗免疫24h后鳃、头肾、脾脏和肠的表达量显著上升(P0.05)。研究结果为进一步研究鱼类CD4和CD4-2在抗菌免疫反应中的作用提供了基础资料。 相似文献
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本文测定了大黄鱼C3(L.c-C3)和C4(L.c-C4)基因的c DNA全序列。结果表明,L.c-C3和L.cC4序列全长分别为4962bp和5088bp,分别编码1653和1695个氨基酸,N端信号肽序列分别为23和19个氨基酸。推导的氨基酸序列结构分析表明大黄鱼C3和C4与已报道的补体C3、C4同样都具有在功能上比较重要的残基以及保守的硫酯区。分子进化分析表明,L.c-C3和L.c-C4分别与鮸鱼C3、C4的氨基酸同源性最高。实时荧光定量PCR结果显示,L.c-C3和L.c-C4在健康大黄鱼的肝脏、脾脏、肠、鳃、心脏、脑、肌肉和胃这8种组织中都有表达,其中肝脏的表达量最高。在大黄鱼胚胎不同发育时期(从2细胞期到初生仔鱼)中,L.c-C3在各个阶段没有明显的变化,而L.c-C4的表达量有明显升高。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染的大黄鱼肝脏和脾脏中,L.c-C3和L.c-C4的m RNA表达量均明显上调。该结果表明,大黄鱼肝组织C3和C4基因表达变化与溶藻弧菌的侵染密切相关,揭示了C3和C4在大黄鱼抗细菌免疫反应中具有重要的作用。 相似文献
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本研究以鲫鱼(Carassius auratus)为研究对象,采用巢式PCR和RACE技术克隆鲫鱼半胱亚磺酸脱酸酶CSAD基因c DNA序列,并且利用实时荧光定量PCR检测了CSAD m RNA在鲫鱼不同组织和昼夜节律中的相对表达水平,同时还研究了牛磺酸对鲫鱼肠道CSAD m RNA表达的影响。结果表明:(1)鲫鱼CSAD基因c DNA序列包含186bp的5?UTR序列,675bp的3?UTR序列,1503bp开放阅读框,编码500个氨基酸。同源性分析表明,鲫鱼和鲤鱼的同源性为97.2%。系统发育分析表明,鲫鱼与鲤鱼之间的亲缘关系最接近,置信度为100。经预测,其编码的蛋白质的分子量和等电点分别为56.82k Da和5.77;(2)Ca CSAD m RNA在肌肉、心脏、肠道及肝脏中的表达水平较高,在脑和鳃组织中的相对表达量较低;(3)鲫鱼肠道CSAD m RNA的相对表达量在6:00am点时最高,9:00pm点时相对表达量最低;(4)鲫鱼CSAD的相对表达丰度随着牛磺酸添加量的增加而逐渐下降。本研究结果不仅有助于理解鲫鱼CSAD基因的分子特征,同时将为进一步研究鱼类CSAD营养调控功能提供理论依据。 相似文献
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翘嘴红鲌(Erythroculterilishaeformis)是大型淡水鱼类鳊鲌亚科(Abramidinae)中最大的一种鱼,具有较高的经济价值。但其饲料转化率及抗病性研究相对较少,相关基因信息缺乏。本研究以翘嘴红鲌为对象,利用RACE技术克隆翘嘴红鲌果糖-1.6-二磷酸醛缩酶(ALDO-C)基因,该基因cDNA全长1945bp,其中ORF区975bp,编码325个氨基酸.5′非编码区933bp.3′非编码区37bp。通过实时荧光定量PCR检测了ALDO-C在不同组织中相对表达水平。发现ALDO-C基因在翘嘴红鲌的肾、肝、肌肉、性腺中均有表达,且在肾中表达量最高,显著高于其他组织。同时采用石蜡切片、H.E染色和原位杂交染色,观察分析翘嘴红鲌的肾组织显微结构和ALDO-C基因的表达定位,结果表明,ALDO-C在鱼类肾单位和集合管结构、调节肾组织水平衡及抗病性方面有重要作用。可以考虑将翘嘴红鲌醛缩酶C基因作为生长发育及抗病性相关的候选基因,用于翘嘴红鲌鱼的分子辅助育种,以期为今后的研究提供理论基础。 相似文献
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促肾上腺皮质激素释放激素结合蛋白(CRH-BP)是一种糖基化蛋白,与促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)具有很高的亲和力,对CRH诱导的脑垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)的释放起到抑制作用。本研究采用RT-PCR与RACE基因克隆方法首次获得太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)CRH-BP基因全长cDNA序列(GenBank登录号:MF289345)1950bp,其中ORF区1245bp编码415个氨基酸,5′非编码区841bp,3′非编码区294bp,理论分子量/等电点为45.816/5.87。生物学序列分析结果表明,太平洋真宽水蚤CRH-BP氨基酸序列与桡足类中近亲真宽水蚤同源性最高;具有6个蛋白修饰位点及蛋白家族标签序列,具有明显的跨膜结构域及信号肽。实时荧光定量PCR分析结果表明,太平洋真宽水蚤CRH-BP基因在盐度、温度及pH环境胁迫中的mRNA表达量均具有一定的时间梯度表达性与浓度梯度表达性特征。本文通过对太平洋真宽水蚤CRH-BP基因结构及不同环境因子刺激下的表达特点的研究为探究桡足类在环境应激、生殖生理及免疫调控等方面奠定了理论基础。 相似文献
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利用构建的SMART cDNA文库和高通量测序方法,得到了青蛤溶菌酶相关基因的全长,采用荧光定量RT-PCR方法分析了c型溶菌酶基因在鳗弧菌刺激下的表达变化。结果表明,青蛤有c型溶菌酶和i型溶菌酶基因,分别编码155和182个氨基酸,c型溶菌酶信号肽为21个氨基酸并具有典型的LYZ1结构域,i型溶菌酶信号肽为19个氨基酸,其结构域为Destabilase domain结构,用于识别和切断谷氨酰胺-甲酰胺与赖氨酸ε-氨基之间的肽键。荧光定量PCR结果显示,在鳗弧菌刺激后6—24h,青蛤血细胞中c型溶菌酶的表达量出现明显上调的趋势,与对照组有显著性差异(P0.05),说明c型溶菌酶基因在青蛤的免疫应答中起重要的作用。 相似文献
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在鳗弧菌侵染下,利用SMART方法构建了青蛤的cDNA文库,并采用高通量测序方法和BLASTX比对筛选出ESTs及免疫相关因子的基因.结果表明,所构建的cDNA文库的库容量为1.12×106,插入片段均在500bp以上;大于100bp的有效ESTs序列1113条,平均长度725bp,拼接后获得一致性序列420条,其中包括126个叠联群和294个单拷贝EST,BLASTX比对后获得注释序列271条,进一步筛选获得青蛤免疫相关因子基因序列45条,为克隆其免疫防御相关因子的基因提供了重要的基础. 相似文献
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采用微卫星分子标记技术分析验证了133对微卫星分子标记,以期为大菱鲆(Scophthalmus maximus)育种提供合适的抗鳗弧菌分子标记。实验鱼经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染,分为非抗病组与抗病组。对两组鱼PCR扩增出的差异条带进行个体统计,再进行微卫星位点与抗鳗弧菌的相关性分析,并分析对比了两组鱼的遗传多样性。结果表明,微卫星位点Sma-USC108、Sma-USC141的等位基因片段分别在215bp和200bp与抗鳗弧菌性状的正相关性极显著,相关系数分别达到0.363和0.407(P0.01);微卫星位点FF0911、Sma-USC62、Sma-USC279的等位基因片段分别在189bp、163bp和236bp与抗鳗弧菌性状的负相关性极显著,相关系数分别达到–0.377、–0.364和–0.363(P0.01)。经过二次验证,最终确定Sma-USC141和FF0911两个微卫星位点可指导大菱鲆抗鳗弧菌的辅助育种。两组大菱鲆的群体遗传多样性分析对比表明:抗病群体与非抗病群体的遗传变异水平较低,两个群体的遗传多样性水平相当。 相似文献