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1.
【目的】克隆溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901 vscH基因,并分析其序列结构。【方法】参照Gen Bank上的溶藻弧菌全基因组序列设计1对特异性引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的Ⅲ型输出蛋白Yop R核心家族蛋白vscH基因全长,用生物信息学手段分析VscH序列,构建VscH系统进化树及亚基三维结构模型。【结果】vscH基因序列全长636 bp,编码211个氨基酸,推导的蛋白分子质量为24.09 ku。经预测,VscH不存在信号肽与跨膜区;含有2个ASN-糖基化位点,14个磷酸化位点,2个N-豆蔻酰化位点,2个内质网靶向序列及2个微体C-末端靶信号位点;有1个主要功能域,T3SS_needle_reg(第71-211氨基酸);α-螺旋占66.35%,无规则卷曲占23.22%,延伸链占5.69%,β-折叠占4.74%;可能的B细胞抗原优势表位,分别是第20~23,25~28,37~40,48~51和109~112区段。溶藻弧菌VscH系统进化树与弧菌(Vibrio)聚为一簇。VscH亚基三维结构模型与鼠疫耶尔森菌毒力因子Yop R蛋白的编码基因ysc H相似。 相似文献
2.
李亚 《广东海洋大学学报》2011,(4)
通过绿僵菌属甘露糖6-磷酸异构酶基因保守核苷酸区域设计简并性引物,采用RT-PCR及RACE-PCR技术成功克隆了金龟子绿僵菌mpi基因cDNA序列。该基因cDNA序列全长为1 513 bp,开放阅读框长度为1 328 bp,共编码441氨基酸。BLAST分析发现该基因演绎的氨基酸序列与其它真菌同源性较高,蛋白结构分析表明MPI蛋白是较保守的蛋白磷酸酶结构特征,主要由α螺旋和不规则卷曲构成。 相似文献
3.
《广东海洋大学学报》2016,(4)
根据NCBI上登录的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列,设计一对克隆溶藻弧菌HY9901株Ⅲ型分泌系统"分子尺"蛋白VscP全长基因的特异性引物,PCR扩增获得基因的全长片段。结果显示,vsc P(Gen Bank登录号FR780678)开放阅读框ORF为1 206 bp,共编码401个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列预测其分子质量约为44.4 ku,等电点为5.72。Signal 4.1 Server和TMHMM Server 2.0预测结果表明,VscP无信号肽与跨膜结构域。Soft Berry-Psite预测结果显示,VscP含有3个N端糖基化位点,2个cAMP及c GMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,5个蛋白激酶C磷酸化位点,9个酪蛋白激酶II磷酸化位点,2个N端豆蔻酰基化位点,1个酰胺化位点和3个微体C末端靶信号位点。运用MEGA6.0构建的VscP系统进化树显示,溶藻弧菌VscP与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)聚为一簇。应用SWISS-MODEL软件构建VscP亚基三维结构模型发现,其与鞭毛Fil K蛋白有相似构型。 相似文献
4.
《广东海洋大学学报》2016,(3)
提取溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的总DNA,克隆溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶基因cbs,对其进行生物信息学分析。结果表明,所克隆溶藻弧菌cbs基因的开放阅读框为1 095 bp,编码364个氨基酸。氨基酸序列比对发现,溶藻弧菌的CBS蛋白与其他弧菌的CBS相似性极高,与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)CBS氨基酸序列相似性达98%;CBS蛋白质的二级结构为典型的"α+β"折叠模式,无跨膜结构及信号肽。构建cbs基因表达载体(p GEX-cbs)以表达重组蛋白,结果显示,cbs基因在大肠杆菌BL21中高效表达,可表达出分子质量约为66.4 ku的融合蛋白。对表达条件进行优化,发现在37℃、IPTG浓度0.6 mmol/L的条件下诱导5 h后,CBS蛋白的表达量较多,该蛋白主要以包涵体形式存在。 相似文献
5.
《广东海洋大学学报》2016,(3)
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是引起我国南方罗非鱼链球菌病的主要病原之一,SodA是无乳链球菌重要的毒力因子之一。根据链球菌sod A基因保守区设计引物,采用PCR扩增sod A基因部分序列,反向PCR和巢式PCR扩增其侧翼序列,成功获得无乳链球菌sod A基因。无乳链球菌sod A基因序列全长为699 bp,含开放阅读框609 bp,可编码202个氨基酸,演绎的SodA蛋白主要由α螺旋和不规则卷曲构成。BLAST分析表明,该蛋白氨基酸序列与犬链球菌(S.canis)及副乳房链球菌(S.parauberis)相应蛋白的氨基酸序列相似性分别高达80%和79%。将sodA基因克隆至原核表达载体pET28a上成功构建了重组质粒p ET28a-sod A,导入Escherichia coli BL21(DE3),诱导表达的重组蛋白质分子质量约为24 ku,主要以包涵体形式存在于表达菌中。 相似文献
6.
双组分调控系统（Two-component Regulatory System）在致病菌的生长及毒力调控中起重要作用.克隆溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）HY9901 株组氨酸激酶PhoR 和反应调控因子PhoB 的全长基因,并对其进行生物信息学分析.序列分析结果显示,phoR（GenBank 登录号：KJ958404）全长1 299 bp,共编码432 个氨基酸;phoB（GenBank 登录号：KJ863646）全长690 bp,编码229 个氨基酸.构建PhoR/PhoB 的系统进化树,结果显示,溶藻弧菌PhoR/PhoB 与副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈氏弧菌（Vibrio harveyi）有较近亲缘关系.利用SWISS-MODEL 软件,对PhoR/PhoB 中两个相对保守的功能域HATPase_c 和REC 进行同源建模,发现HATPase_c具有1 个ATP 结合位点,REC 具有4 个天冬氨酸活性位点. 相似文献
7.
《广东海洋大学学报》2017,(3)
用同源克隆和RACE的方法克隆红笛鲷(Lutjanus sanguineus)白细胞介素1受体相关激酶1(Interleukin-1receptor-associated kinase 1,IRAK-1)基因的cDNA全序列,并用荧光定量PCR分析其在健康鱼及哈维弧菌感染后红笛鲷的组织表达。结果表明,该序列全长3 207 bp(登录号KF728204),包含5′非编码区(UTR)202 bp,3′UTR752 bp,开放阅读框(ORF)2 253 bp,编码750个氨基酸。根据推导的氨基酸序列预测其蛋白分子质量为82.6 ku,理论等电点为6.59。IRAK-1包含1个N端死亡结构域、proST结构域、中央激酶结构域和C末端结构域。荧光定量PCR分析显示,红笛鲷IRKA-1基因在肝脏和皮肤的表达量最高,其次是心脏、鳃、肌肉和胸腺,其余组织的表达量较低。哈维弧菌侵染红笛鲷后,各组织中IRAK-1基因mRNA表达量均呈上调趋势,肝组织中变化最显著。 相似文献
8.
为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)注射装置蛋白VscO作为疫苗候选抗原的可能性,根据GeneBank上登陆的溶藻弧菌VscO序列(NO.KJ179947),设计1对带酶切位点的特异性引物,PCR扩增vscO基因,序列分析结果显示,该基因全长462 bp,理论分子质量为18.430ku。将vscO基因定向插入原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-vscO。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达分子质量约为22 ku的VscO融合蛋白,且该蛋白主要以包涵体形式存在。VscO蛋白表达和纯化的最优条件为:0.1 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导4 h,咪唑洗脱浓度为400 mmol/L。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,获得高效多克隆抗体。Western-blotting结果表明,鼠抗VscO血清既能与重组VscO蛋白发生反应,也能与分离自溶藻弧菌约22 ku的天然蛋白发生反应,提示T3SS注射装置蛋白VscO可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一。 相似文献
9.
《广东海洋大学学报》2020,(3)
【目的】了解大刺鳅(Mastacembelus armatus)肌肉生长抑制素(myostatin)基因mstn的序列及其在生长发育中的调控功能。【方法】利用RACE方法克隆大刺鳅mstn全长cDNA序列,采用荧光定量PCR分析其在不同组织和胚胎发育阶段的表达情况。【结果与结论】大刺鳅mstn cDNA序列全长2 690 bp,包含200 bp 5′非编码区、1 359 bp 3′非编码区和1 131 bp开放阅读框,编码376个氨基酸。前22个氨基酸残基为信号肽,第37～254位氨基酸残基为TGF-β前肽域,第282～376位是TGF-β结构域,具蛋白酶水解位点RARR和C端生物活性区的9个保守半胱氨酸残基。系统发育分析表明,大刺鳅MSTN氨基酸序列与合鳃目、鲈形目鱼类同源性较高,与哺乳动物、鸟类、爬行类、两栖类同源性较低。实时定量PCR分析表明,大刺鳅mstn基因在各组织中均有表达,肌肉中表达量最高,眼、脑次之,鳃表达量最低;大刺鳅胚胎发育的各阶段mstn基因均有表达,囊胚期表达量最高,其次为多细胞期,出膜期表达量最低。 相似文献
10.
【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TRADD)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝PmTRADD基因的c DNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmTRADD基因在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmTRADD包含5′非编码区101 bp,3′非编码区144 bp和开放阅读框(ORF)591 bp,编码196个氨基酸。序列分析表明,PmTRADD没有信号肽和跨膜结构域,C端含有一个死亡结构域(DEATH)。将PmTRADD死亡结构域的氨基酸序列与其他物种的TRADD死亡结构域序列进行比对,发现不同物种的TRADD死亡结构域序列同源性较低。PmTRADD在马氏珠母贝各组织中均有不同程度表达,在鳃组织中表达最高,肝胰腺次之,闭壳肌中基本无表达。 相似文献
11.
根据溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)二氢硫辛酰胺脱氢酶(dihydrolipoamide dehydrogenase,DLD)的基因序列设计1对特异性引物。PCR扩增结果显示,DLD(GenBank登录号AGK62253)全长1 428 bp,共编码475个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列预测其分子质量约为50.998 ku,等电点为5.51。细胞定位、SignalP 4.0、TMHMM Server 2.0和SoftBerry-Psite预测结果显示,DLD位于细胞质中,在第29至30个氨基酸之间存在信号肽,不存在跨膜区,氨基酸序列含有1个Asn-糖基化位点、5个蛋白激酶C磷酸化位点、6个酪蛋白激酶II磷酸化位点等多个活性位点。系统进化树结果显示,溶藻弧菌DLD与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)聚为一簇。用Kyte-Doolittle亲水性参数、Karplus-Schulz柔韧性参数、Emini表面可及性参数和Jameson-Wolf抗原性参数分别预测,DLD可能的B细胞抗原优势表位分别是第5~10、106~110、120~125、158~163和175~180区段。利用SWISS-MODEL软件,模拟DLD亚基三维结构模型,结果显示其与大肠杆菌(Escherichia coli)DLD蛋白有相似构型。Kegg分析发现,其涉及糖酵解和糖异生等9条信号通路。从生物信息学角度验证了DLD作为弧菌共同抗原的可行性。 相似文献
12.
《广东海洋大学学报》2017,(1)
采用c DNA末端快速扩增技术克隆获得马氏珠母贝清道夫受体基因c DNA全长序列(Pm SR-B);利用荧光定量技术检测Pm SR-B基因在各个组织中的表达量。结果表明,Pm SR-B基因c DNA序列全长1 857 bp,开放阅读框(ORF)长1 443 bp,编码480个氨基酸,5′非翻译区(5′UTR)长89 bp,3′UTR长325 bp。预测其分子质量为54.77 ku,等电点为7.94,脂溶性系数92.94,总平均亲水性-0.120,属于疏水性蛋白;不稳定指数26.37,属于稳定蛋白。氨基酸序列同源比对结果,Pm SR-B氨基酸序列与其他物种具有一定的保守性,与华贵类栉孔扇贝(Mimachlamys nobilis)SR-B的序列的相似度高达47%。荧光定量PCR检测结果,Pm SR-B在肝胰腺中表达量最高,其后依次是鳃、闭壳肌、中央膜,各组织的表达量差异具统计学意义(P0.05)。 相似文献
13.
用RT-PCR和RACE方法,从荷那龙罗非鱼(Oreochromis hornorum)垂体中克隆到生长激素促分泌素受体(GHSR)cDNA全序列。荷那龙罗非鱼GHSR基因具有GHSR-1a与GHSR-1b两个高度保守cDNA序列。GHSR-1a序列全长1 646 bp,包括225 bp的5′非编码区,266 bp的3′非编码区和1 155 bp的开放阅读框,编码384个氨基酸残基,具有7个跨膜结构域结构(transmembrane domains,TM);GHSR-1b序列全长1 877 bp,包括225 bp的5′非编码区,755 bp的3′非编码区和897 bp的开放阅读框,编码298个氨基酸残基,只具有前5个TM,在第6个TM的第4个氨基酸处开始缺失。将GHSR cDNA序列与基因组序列比较发现,这两种cDNA转录本来自同一个基因的不同变体。 相似文献
14.
《广东海洋大学学报》2020,(5)
【目的】克隆大珠母贝(Pinctada maxima)胰岛素相关肽受体PmIRR基因,并分析其在不同组织中的表达。【方法】利用c DNA快速末端克隆技术(RACE)获得大珠母贝PmIRR基因cDNA全长序列。荧光定量PCR技术分析PmIRR在闭壳肌、鳃、外套膜边缘区、套膜区、中央区、足和肝胰腺等组织的表达模式。【结果与结论】PmIRR基因全长6 009 bp,5′非编码区(UTR)615 bp、3′UTR 764 bp、开放阅读框(ORF)长4 629 bp、编码1 542个氨基酸。序列分析表明,PmIRR含有保守结构域Fu、3个FNⅢ结构域和Tyrkc结构域,并含有信号肽和2个跨膜结构域。PmIRR在大珠母贝各个组织存在差异表达,在鳃、肝胰腺和外套膜边缘区中显著高表达。 相似文献
15.
白细胞介素-1受体相关激酶4(interleukin-1 receptor-associated kinase 4,IRAK-4)是一种参与机体先天性免疫和适应性免疫反应过程中的关键分子。采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增(RACE-PCR)的方法从红笛鲷(Lutjanus sanguineus)头肾中克隆IRAK-4基因的c DNA全序列(登录号:KF279357)。该序列全长2 015 bp,包含5′非编码区(5′UTR)205 bp,3′非编码区(3′UTR)421 bp,开放阅读框(ORF)1 389 bp,编码462个氨基酸。根据推导的氨基酸序列预测其蛋白分子质量为52.0 ku,理论等电点为5.19。氨基酸序列比对结果显示,红笛鲷IRKA-4基因氨基酸序列与其他物种的同源性为54.2%~85.7%。系统进化分析结果显示,红笛鲷与斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)聚为一支,两者有较近的亲缘关系。用荧光定量PCR分析红笛鲷基因的组织表达差异,红笛鲷IRKA-4基因在各组织中均有不同程度的表达,其中在皮肤、肝脏和胃中表达量最高,其次是胸腺、鳃、心脏、肠、肌肉和脾脏,在头肾、后肾和脑的表达量最低。 相似文献
16.
【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)法尼酸甲基转移酶(FAMe T)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝FAMeT(PmFAMeT)基因的cDNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmFAMeT在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmFAMeT包含5′非编码区120 bp,3′非编码区968 bp和开放阅读框(ORF)1 536 bp,编码511个氨基酸。序列分析表明,PmFAMeT含有信号肽序列和跨膜结构域,并有WSC结构域、TSP1结构域和2个Methyltransf_FA结构域。将推导的PmFAMeT氨基酸序列与其他物种的FAMeT序列进行比对发现,不同物种的Methyltransf_FA序列同源性较高。PmFAMeT在马氏珠母贝的各个组织中均有表达,且在边缘膜、肝胰腺和性腺中的表达量显著高于其他组织。 相似文献
17.
《广东海洋大学学报》2015,(3)
采用RACE-PCR克隆卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)肉碱棕榈酰基转移酶Ⅰ(carnitine palmitoyltransferaseⅠ,CPTⅠ)c DNA序列全长,并对其编码氨基酸进行生物信息学分析。结果表明,卵形鲳鲹CPTⅠ基因(Gen Bank登录号KP987456)c DNA序列全长2 841 bp,其开放阅读框(ORF)为2 363 bp,编码787个氨基酸,3'非编码区(URT)335 bp,5'非编码区142 bp;生物信息预测显示CPTⅠ基因编码的蛋白无信号肽序列,脂溶指数高达85.63,亲水性平均值(GRAVY)为-0.213,具有2个跨膜区螺旋,在第312和367氨基酸残基处存在N-糖基化位点,在19个丝氨酸(Ser)、9个苏氨酸(Thr)和14个酪氨酸(Tyr)残基上可能发生磷酸化;二级结构中α螺旋(Alpha helix)占比例最大,为40.66%;该蛋白亚细胞定位预测其主要分布于细胞质和线粒体中;分子系统进化分析显示,卵形鲳鲹CPTⅠ蛋白与花鲈(Lateolabrax japonicas)的同源性最高,达94%,与大黄鱼(Larimichthys crocea)、金鲷(Sparus aurata)的次之,均为93%,与人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)等的同源性较低(65%)。 相似文献
18.
《广东海洋大学学报》2016,(1)
根据Gen Bank中公布的哈维氏弧菌qnr基因序列设计引物扩增哈维氏弧菌qnr序列,将其插入p ET-32a质粒,构建原核表达载体p ET32-qnr,并对诱导温度、时间、IPTG浓度等条件进行优化。结果表明,哈维氏弧菌qnr全长651 bp,编码216个氨基酸;重组蛋白优化条件为于28℃、IPTG浓度为0.05 mmol/L条件下诱导6 h。 相似文献
19.
为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901血红素结合蛋白HutB作为疫苗候选抗原的可能性,采用PCR方法扩增V.alginolyticus HY9901 hutB基因全长序列,克隆到pMD18-T载体,经双酶切、连接后,定向插入到pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET-HutB,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE验证后,优化诱导表达条件和纯化条件,并进行Western-blot分析。结果表明,HutB蛋白在E.coli中诱导表达的最优条件:0.4 mmol/L IPTG,37℃诱导4h,表达的蛋白分子量与预期大小相符,主要以包涵体的形式存在,300 mmol/L咪唑洗脱时效果最佳,能与鼠抗His-tag单抗特异性结合。 相似文献
20.
《广东海洋大学学报》2017,(3)
克隆并鉴定墨吉明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)的一种c型溶菌酶基因(Fm-Lyz),其cDNA全长为770 bp,包括71 bp的5′非编码区(UTR)、222 bp的3′UTR和477 bp完整开放阅读框,编码158个氨基酸。SMART分析显示,Fm-Lyz氨基酸序列包含1个LYZ1结构域和1个含18个氨基酸的信号肽。同源性分析发现,Fm-Lyz与斑节对虾(Penaeus monodon)溶菌酶同源性最高;进化树结果显示,Fm-Lyz与不同对虾的c型溶菌酶聚为一类。实时荧光定量PCR结果显示,Fm-Lyz在所测组织中均有表达,其中在血细胞中表达量最高。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)感染后,Fm-Lyz表达量比对照组明显上调(P0.05),最高表达量时间分别为感染后24、12 h,暗示Fm-Lyz参与了墨吉明对虾的抗菌免疫防御。 相似文献