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溶藻弧菌引起海水养殖产业弧菌病的主要病原,附着定植因子基因acfA是溶藻弧菌重要毒力基因之一,其表达产物是溶藻弧菌有效定植在宿主肠道上所必需的蛋白。根据弧菌属细菌acfA基因基因保守区设计引物,采用Touchdown PCR扩增acfA基因部分序列,Inverse PCR和Nested PCR扩增已知序列侧翼序列,成功克隆了溶藻弧菌acfA基因全长。克隆的acfA基因序列全长为743 bp,开放阅读框长度为648 bp组成,共编码215个氨基酸,在5′端上游未发现-35区和-10区序列。演绎的ACFA蛋白N端有18个氨基酸信号肽序列,表明该蛋白是分泌型蛋白;蛋白结构分析表明主要由α螺旋和不规则卷曲构成。BLAST分析表明,该蛋白氨基酸序列与其他弧菌相应蛋白同源性较高,是较保守的外膜蛋白。 相似文献
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根据NCBI数据库中已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列合成一对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR技术)扩增溶藻弧菌HY9001菌株dtd基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a构建重组表达质粒pET-DTD,并对其进行诱导温度、诱导时间、诱导IPTG浓度等条件的优化,最后探究其纯化时最佳咪唑洗脱浓度。结果表明:DTD蛋白成功表达,且其以包涵体的形式存在,在诱导温度37℃、IPTG浓度0.1 mmol/L条件下诱导5 h表达量最高,纯化最佳咪唑洗脱浓度为150 mmol/L。 相似文献
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为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901血红素结合蛋白HutB作为疫苗候选抗原的可能性,采用PCR方法扩增V.alginolyticus HY9901 hutB基因全长序列,克隆到pMD18-T载体,经双酶切、连接后,定向插入到pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET-HutB,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE验证后,优化诱导表达条件和纯化条件,并进行Western-blot分析。结果表明,HutB蛋白在E.coli中诱导表达的最优条件:0.4 mmol/L IPTG,37℃诱导4h,表达的蛋白分子量与预期大小相符,主要以包涵体的形式存在,300 mmol/L咪唑洗脱时效果最佳,能与鼠抗His-tag单抗特异性结合。 相似文献
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【目的】克隆溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901 vscH基因,并分析其序列结构。【方法】参照Gen Bank上的溶藻弧菌全基因组序列设计1对特异性引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的Ⅲ型输出蛋白Yop R核心家族蛋白vscH基因全长,用生物信息学手段分析VscH序列,构建VscH系统进化树及亚基三维结构模型。【结果】vscH基因序列全长636 bp,编码211个氨基酸,推导的蛋白分子质量为24.09 ku。经预测,VscH不存在信号肽与跨膜区;含有2个ASN-糖基化位点,14个磷酸化位点,2个N-豆蔻酰化位点,2个内质网靶向序列及2个微体C-末端靶信号位点;有1个主要功能域,T3SS_needle_reg(第71-211氨基酸);α-螺旋占66.35%,无规则卷曲占23.22%,延伸链占5.69%,β-折叠占4.74%;可能的B细胞抗原优势表位,分别是第20~23,25~28,37~40,48~51和109~112区段。溶藻弧菌VscH系统进化树与弧菌(Vibrio)聚为一簇。VscH亚基三维结构模型与鼠疫耶尔森菌毒力因子Yop R蛋白的编码基因ysc H相似。 相似文献
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根据溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)二氢硫辛酰胺脱氢酶(dihydrolipoamide dehydrogenase,DLD)的基因序列设计1对特异性引物。PCR扩增结果显示,DLD(GenBank登录号AGK62253)全长1 428 bp,共编码475个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列预测其分子质量约为50.998 ku,等电点为5.51。细胞定位、SignalP 4.0、TMHMM Server 2.0和SoftBerry-Psite预测结果显示,DLD位于细胞质中,在第29至30个氨基酸之间存在信号肽,不存在跨膜区,氨基酸序列含有1个Asn-糖基化位点、5个蛋白激酶C磷酸化位点、6个酪蛋白激酶II磷酸化位点等多个活性位点。系统进化树结果显示,溶藻弧菌DLD与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)聚为一簇。用Kyte-Doolittle亲水性参数、Karplus-Schulz柔韧性参数、Emini表面可及性参数和Jameson-Wolf抗原性参数分别预测,DLD可能的B细胞抗原优势表位分别是第5~10、106~110、120~125、158~163和175~180区段。利用SWISS-MODEL软件,模拟DLD亚基三维结构模型,结果显示其与大肠杆菌(Escherichia coli)DLD蛋白有相似构型。Kegg分析发现,其涉及糖酵解和糖异生等9条信号通路。从生物信息学角度验证了DLD作为弧菌共同抗原的可行性。 相似文献
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双组分调控系统（Two-component Regulatory System）在致病菌的生长及毒力调控中起重要作用.克隆溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）HY9901 株组氨酸激酶PhoR 和反应调控因子PhoB 的全长基因,并对其进行生物信息学分析.序列分析结果显示,phoR（GenBank 登录号：KJ958404）全长1 299 bp,共编码432 个氨基酸;phoB（GenBank 登录号：KJ863646）全长690 bp,编码229 个氨基酸.构建PhoR/PhoB 的系统进化树,结果显示,溶藻弧菌PhoR/PhoB 与副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈氏弧菌（Vibrio harveyi）有较近亲缘关系.利用SWISS-MODEL 软件,对PhoR/PhoB 中两个相对保守的功能域HATPase_c 和REC 进行同源建模,发现HATPase_c具有1 个ATP 结合位点,REC 具有4 个天冬氨酸活性位点. 相似文献
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为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)注射装置蛋白VscO作为疫苗候选抗原的可能性,根据GeneBank上登陆的溶藻弧菌VscO序列(NO.KJ179947),设计1对带酶切位点的特异性引物,PCR扩增vscO基因,序列分析结果显示,该基因全长462 bp,理论分子质量为18.430ku。将vscO基因定向插入原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-vscO。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达分子质量约为22 ku的VscO融合蛋白,且该蛋白主要以包涵体形式存在。VscO蛋白表达和纯化的最优条件为:0.1 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导4 h,咪唑洗脱浓度为400 mmol/L。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,获得高效多克隆抗体。Western-blotting结果表明,鼠抗VscO血清既能与重组VscO蛋白发生反应,也能与分离自溶藻弧菌约22 ku的天然蛋白发生反应,提示T3SS注射装置蛋白VscO可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一。 相似文献
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