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【目的】对Galectin-3蛋白进行纯化,优化诱导相关表达条件,为大量获取罗非鱼Galectin-3蛋白提供方案。【方法】根据NCBI上已公布的罗非鱼(Oreochromismossambicus)Galectin-3基因序列,设计多对带Eco RI和Xhol酶切位点的引物,筛选出良性扩增引物,对罗非鱼cDNA经进行聚合酶链式反应(PCR)扩增、限制性快切酶双酶切、T4连接酶连接等步骤,构建罗非鱼Galectin-3基因的原核表达质粒pGEX-4T-Galectin-3,将重组质粒导入大肠杆菌BL21中,进行Galectin-3重组蛋白的表达。并比较不同的诱导温度、诱导时间、IPTG浓度条件下的表达效果,对Galectin-3蛋白表达最优条件进行筛选。【结果】构建了罗非鱼Galectin-3原核表达质粒,进行Galectin-3重组蛋白后发现37℃下,0.4 mmol/L浓度的IPTG诱导5 h即可诱导Galectin-3重组蛋白高效表达。免疫印迹结果显示,经蛋白纯化柱纯化后的pGEX-4T-Galectin-3重组蛋白可与GST-Tag单克隆抗体发生特异性反应,进而表明表达的重组蛋白是罗非鱼的Galectin-3蛋白。【结论】本研究成功构建了罗非鱼Galectin-3基因的原核表达载体,并确定了Galectin-3融合蛋白最适的表达条件:37℃下,0.4 mmol/L浓度的IPTG诱导5 h。 相似文献
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【目的】对哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)ZJ0603的PspF基因进行克隆与原核表达分析,优化表达条件。【方法】克隆哈维氏弧菌菌株ZJ0603的FspF基因,对其编码蛋白进行理化性质、信号肽、亚细胞定位、二级结构及三级结构分析,构建表达载体pET28a-PspF,经BamHI和XhoI双酶切和测序鉴定正确后转入表达菌株大肠杆菌BL21,对表达重组菌株进行表达条件优化及Western Blot鉴定。【结果与结论】PspF基因的开放阅读框(ORF)全长为1 179 bp,编码336个氨基酸,分子质量为38.04 ku,理论等电点5.27,不稳定系数41.97,总平均亲水性-0.382,PspF蛋白整体表现为亲水性蛋白。成功构建含pET28a-PspF的表达菌株,其最佳诱导条件为37℃下异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)0.2 mmol/L诱导6 h,其表达蛋白为38 ku。Western Blot结果表明PspF重组蛋白成功获得,蛋白同源性高,具有作为抗弧菌病疫苗的潜力。 相似文献
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【目的】建立一种快速、灵敏、特异的罗非鱼(Oreochromis spp)罗湖病毒定量检测方法。【方法】根据罗湖病毒节段8保守区设计一对特异性引物,建立检测罗湖病毒的SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了评价。【结果】标准曲线在2.5×10~8～2.5×10~0拷贝数之间有良好的线性关系(相关系数R~2=0.999),检测限为2.5×10~0个拷贝。试验内及试验间变异系数分别为0.11%～0.43%与0.54%～1.13%,重复性强;对水生动物其他病毒和细菌均无扩增反应,有很好的特异性。【结论】新建立的罗湖病毒实时荧光定量PCR检测方法特异性好、灵敏度高、重复性强,可用于TiLV的早期的快速诊断、流行病学调查和防控。 相似文献
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应用已知的标签序列通过RACE-PCR和RT-PCR方法成功克隆红笛鲷(Lutjanus sanguineus)α-珠蛋白和β-珠蛋白基因的全长cDNA序列。α-珠蛋白和β-珠蛋白基因的cDNA全长分别为560和563 bp,开放阅读框分别为429和444 bp,各编码143和148个氨基酸,理论相对分子质量分别为15690和16400,理论等电点为7.79和6.61。氨基酸序列BLAST结果表明,红笛鲷α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因编码的氨基酸序列与其他鱼类的相似性分别在59%~79%和55%~80%之间。用邻接法(Neighbor-Joining)构建的α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因的系统发育树表明,红笛鲷与真鲷(Pagrus major)、金头鲷(Sparus aurata)和鰤(Seriola quinqueradiata)等亲缘关系较近。 相似文献
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为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)注射装置蛋白VscO作为疫苗候选抗原的可能性,根据GeneBank上登陆的溶藻弧菌VscO序列(NO.KJ179947),设计1对带酶切位点的特异性引物,PCR扩增vscO基因,序列分析结果显示,该基因全长462 bp,理论分子质量为18.430ku。将vscO基因定向插入原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-vscO。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达分子质量约为22 ku的VscO融合蛋白,且该蛋白主要以包涵体形式存在。VscO蛋白表达和纯化的最优条件为:0.1 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导4 h,咪唑洗脱浓度为400 mmol/L。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,获得高效多克隆抗体。Western-blotting结果表明,鼠抗VscO血清既能与重组VscO蛋白发生反应,也能与分离自溶藻弧菌约22 ku的天然蛋白发生反应,提示T3SS注射装置蛋白VscO可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一。 相似文献
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根据溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)二氢硫辛酰胺脱氢酶(dihydrolipoamide dehydrogenase,DLD)的基因序列设计1对特异性引物。PCR扩增结果显示,DLD(GenBank登录号AGK62253)全长1 428 bp,共编码475个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列预测其分子质量约为50.998 ku,等电点为5.51。细胞定位、SignalP 4.0、TMHMM Server 2.0和SoftBerry-Psite预测结果显示,DLD位于细胞质中,在第29至30个氨基酸之间存在信号肽,不存在跨膜区,氨基酸序列含有1个Asn-糖基化位点、5个蛋白激酶C磷酸化位点、6个酪蛋白激酶II磷酸化位点等多个活性位点。系统进化树结果显示,溶藻弧菌DLD与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)聚为一簇。用Kyte-Doolittle亲水性参数、Karplus-Schulz柔韧性参数、Emini表面可及性参数和Jameson-Wolf抗原性参数分别预测,DLD可能的B细胞抗原优势表位分别是第5~10、106~110、120~125、158~163和175~180区段。利用SWISS-MODEL软件,模拟DLD亚基三维结构模型,结果显示其与大肠杆菌(Escherichia coli)DLD蛋白有相似构型。Kegg分析发现,其涉及糖酵解和糖异生等9条信号通路。从生物信息学角度验证了DLD作为弧菌共同抗原的可行性。 相似文献
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双组分调控系统（Two-component Regulatory System）在致病菌的生长及毒力调控中起重要作用.克隆溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）HY9901 株组氨酸激酶PhoR 和反应调控因子PhoB 的全长基因,并对其进行生物信息学分析.序列分析结果显示,phoR（GenBank 登录号：KJ958404）全长1 299 bp,共编码432 个氨基酸;phoB（GenBank 登录号：KJ863646）全长690 bp,编码229 个氨基酸.构建PhoR/PhoB 的系统进化树,结果显示,溶藻弧菌PhoR/PhoB 与副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈氏弧菌（Vibrio harveyi）有较近亲缘关系.利用SWISS-MODEL 软件,对PhoR/PhoB 中两个相对保守的功能域HATPase_c 和REC 进行同源建模,发现HATPase_c具有1 个ATP 结合位点,REC 具有4 个天冬氨酸活性位点. 相似文献
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在注射溶藻弧菌胞外产物(ECP)48 h后,石斑鱼Epinephelus akaara出现死亡,临床症状表现为:运动迟缓,体色变深,腹部膨大,腹腔有明显的积水,肝脏出血有花斑,肾脏和脾脏肿大。病理组织切片观察发现:肝细胞坏死,解体,界限模糊,细胞核变形、裂解甚至消失;肝脏出血,肝索中有红细胞浸润,有的红细胞变形甚至破裂;肾小管上皮细胞脱落、坏死;肠粘膜上皮细胞脱落、坏死,微绒毛不整齐,模糊不清,脱落;脾窦和脾索不清晰,分界不清,且在脾窦和脾索中分布着大量的、形态不规则的红细胞。此外,还发现在肝脏、脾脏、肾脏、肠壁肌层、心肌和鳃等组织中存在一种相同结构,该结构有平滑肌环绕,管腔内壁衬以扁平上皮细胞,管腔中含有一团染成紫红色的物质,经推断为小动脉透明样变性,而在正常的组织切片中,均无此结构。 相似文献
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红鳍笛鲷弧菌病病原的研究 总被引：7，自引：0，他引：7
从广东湛江特呈岛鱼排取患病红鳍笛鲷进行病原分离、纯化,得到一株病原菌Ls 1。该菌 为革兰阴性短杆菌,有运动性,菌落半透明,最适温度28～30℃,需盐生长,氧化酶反应阳性,发酵 葡萄糖不产气,不发酵肌醇,对弧菌抑制剂O/129敏感。经API ID32E细菌鉴定系统及弧菌科细 菌生化鉴定管鉴定,该菌为一株溶藻弧菌(Vibrioaginolyticus);其对红鳍笛鲷的半数致死量为6.32 ×105mL-1。药敏试验结果表明,该菌对阿莫西林、先锋V不敏感,对新生霉素、卡那霉素、多粘菌 素B、四环素中度敏感,而对庆大霉素、氟哌酸、氯霉素、红霉素、链霉素和复方新诺明等有较高的敏 感性。 相似文献
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谷胱甘肽系统在清除活性氧和生物保护中发挥重要作用,探讨了南极冰藻胞内谷胱甘肽含量及谷胱甘肽相关酶的活力.采用分光光度法,对24种南极冰藻胞内谷胱甘肽含量、谷胱甘肽合成能力(GPA)、谷胱甘肽还原酶活力等进行测定.测定结果表明,南极蓝藻B-1中谷胱甘肽含量最高;南极衣藻ICE-L和南极硅藻GJ01的谷胱甘肽总产量居前2位;南极冰藻GPA普遍高于常温藻的.南极硅藻GJ01和南极衣藻ICE-L GR活力高于对照组的.培养基的选择表明,f/2培养基适合南极硅藻GJ01的生长,而Provasoli培养基适合南极衣藻ICE-L的生长.可见,南极冰藻成为谷胱甘肽的新来源是有可能的,尤其是南极硅藻GJ01和南极衣藻ICE-L. 相似文献