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针对靶标自环化滚环扩增(TC-RCA)难以高灵敏度检测的难题,本文探究了扩增过程中靶标环化效率低的原因,并构建了新型动态接头以提高靶标DNA的环化灵敏度。通过采用含有发卡结构的动态接头(18 nt),使接头的两端产生连接活性差异,探讨发卡接头打开与闭合的动态平衡在提高环化灵敏度中的作用。具体研究了发卡动态接头的稳定性和磷酸化对连接及环化效率的影响。研究表明,增加接头两端的连接活性差异可提高环化灵敏度(106 copies/μL),从而揭示了TC-RCA灵敏度低的根本原因。由于许多过量的接头同时连接到靶标DNA两端后,靶标无法环化,造成仅有少部分靶标环化为RCA模板,导致极低浓度的靶标无法发生RCA。在此基础上,采用另一种10 nt的短链动态接头,使检测灵敏度提高了两个数量级(达104 copies/μL)。本研究为TC-RCA中接头的设计提供了新思路,对双链DNA环化机理的深入研究具有重要意义。 相似文献
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