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1.
《中国海洋大学学报(自然科学版)》2016,(5)
为进一步研究Thermus aquaticus(Taq)DNA连接酶的作用机理、开发以DNA连接作为关键步骤的新生物技术,本文以含有超稳定发卡结构的DNA(带有11nt长的单链部分)和另一条单链DNA为连接底物,研究了片段长度、反应温度、连接位点的结构特性、聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)的添加等对连接的影响,探讨了Taq DNA连接酶的连接特性。连接结果显示:单链DNA的3’端同发卡结构I底物相连的连接率,比单链DNA的5’端同发卡结构II底物相连的连接率更高;可以连接的最短单链DNA片段的长度为6nt;在20~65℃范围内,一般连接率随温度升高而升高。在连接时,由2条底物通过互补配对形成的复合体的热稳定性对连接率影响不大,一般在连接温度远远高于该复合体的熔点(Melting Temperature,Tm)时仍有很高的连接率。在70或75℃时,虽然连接率有所降低,但仍然可以连接9nt的单链DNA片段。研究还发现,在片段连接上,PEG 6000对较难连接的片段(6~7nt)有促进作用,对容易连接的片段(8~10nt)促进作用不显著,甚至有一定抑制作用。 相似文献
2.
以东海原甲藻的ITS序列(Internal transcribed spacer,ITS)为检测靶标,将生物素标记的环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)扩增产物与经异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针特异性杂交,并结合横向流动试纸条(Lateral flow dipstick,LFD)肉眼直接观察检测结果,建立了有害赤潮藻东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)的快速检测技术。经优化后的最适条件为63°C、30min,较常规PCR扩增缩短约2h。结果表明:LAMPLFD可特异性检出东海原甲藻,对常见赤潮藻检测结果均为阴性;其对东海原甲藻基因组DNA的检测最低限为47pg/μL,是常规PCR技术(以F3/B3为引物)的10倍。LAMP-LFD技术能高效、特异地检出东海原甲藻,仪器设备依赖性低,结果可视化,有望成为赤潮原因种检测监控的常规方法。 相似文献
3.
为了利用ISSR分子标记技术对坛紫菜(Porphyra haitanensis)种质资源进行遗传分析及种质鉴定,获得清晰稳定、重复性好、多态性高的扩增结果,对影响ISSR-PCR扩增的多个因素,包括DNA模板含量、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶含量、引物浓度、dNTP浓度以及复性温度进行了全面比较和优化,建立了坛紫菜种质资源ISSR-PCR扩增的最佳反应体系:25μL的反应体系中含2.5μL 10×PCR缓冲液,5 ng模板DNA,2.5 mmol/L Mg2+,1.5 UTaqDNA聚合酶,200 nmol/L引物,200μmol/L dNTP。最佳PCR扩增程序:94℃预变性7 min;每个循环94℃变性1 min,48℃复性45 s,72℃延伸2 min,共进行35个循环;循环结束后72℃再延伸7 min。 相似文献
4.
环境样品的低生物量是微生物宏基因组学研究面临的首要挑战,通过基因组扩增技术来满足高通量测序对DNA样品量的需求是最常用的解决策略。MALBAC(Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles)基因组扩增试剂盒最初为扩增和研究哺乳动物的单细胞基因组而研发。本文中,我们通过人工构建的微生物群落来检测该试剂盒在微生物宏基因组扩增方面的效率和应用可行性。结果表明,每个标准反应中,10 pg的DNA模板量足以满足MALBAC试剂盒对样品扩增的需要。每个标准反应DNA模板用量为10和100 pg时,所扩增DNA样品的基因组覆盖度与原始未扩增样品表现出高度的一致性,证明MALBAC试剂盒扩增效果的高度稳定性和一致性。常用的GenomePlex全基因组扩增试剂盒使我们可以在每个标准反应DNA模板量为100 pg的条件下扩增获得足够的DNA样品,但是结果表明该参照试剂盒无法有效的实现对群落中低丰度细菌菌株基因组的线性扩增。对于MALBAC试剂盒和参照试剂盒而言,在扩增高GC含量的微生物物种基因组DNA方面效率低下。我们的实验结果表明MALBAC试剂盒在高效扩增环境样品宏基因组DNA方面的可行性,但对该试剂盒在扩增环境样品中高GC含量微生物物种方面的适用性存在疑虑。 相似文献
5.
海水中活性磷酸盐的萃取比色测定研究 总被引：1，自引：0，他引：1
磷钼蓝法测定海水中活性磷酸盐的检测下限约为0.020μmol·P/L。在多数海洋研究工作中,这样的灵敏度是令人满意的。但是,在我国的许多沿岸海区,在浮游植物生长繁殖旺盛春末夏初季节,由于磷酸盐被大量的消耗,在水体中其含量相当低,因此,对此类海区的调查研究以及特殊的生物学研究来说,常常需要测定更低的磷酸盐。为此,作者进行了它的萃取比色法研究。本方法是在磷钼蓝法的基础上,外加了醇类溶剂萃取步骤;检测下限提高到0.002μmol·P/L,测定范围为0.002-0.800μmol·P/L。适用于低磷海区,以及特殊生物学调查研究工作。 相似文献
6.
介绍了一种制备海洋浮游生物PCR模板DNA的方法——碱煮法。取少量海水样品(40μL)．直接经0．25mol／L艺机NaOH和99℃温育处理裂解细胞，从而得到环境样品总DNA。实验证明，该方法制备的模板DNA可用于细菌核糖体RNA、浮游植物叶绿体rbcL和浮游动物线粒体COI等基因的PCR扩增。但是，在使用通用引物扩增细菌基因时，假阳性很难避免。该法制备的模板DNA适用于扩增非细菌基因或者特异引物界定的细菌基因。该方法较传统制备方法快速、简便，样品需要量减少，适用于浮游生物分子遗传多样性研究。 相似文献
7.
用小规模提取法从海带“90l”,品系的配于体中提取基因组DNA,用于随机扩增多态DNA(RAPD)的重复性及稳定性研究。通过对扩增体系中各因子和扩增程序的梯度试验,确定其优化反应体系为：50ng模板DNA,2.0mmol/LMgCl2,0.2mmol/L dNIP,0.2μmol/L引物,1．5UTaq酶;所得PCR反应程序为：94℃预变性5min,45个循环：变性94℃30s,退火36℃1min,延伸72℃2min,最后72℃延伸10min。本研究条件获得的RAPD图谱有较好的重复性和特异性,为深入研究海带“901”品系的遗传和变异提供了方法依据。 相似文献
8.
三丁基锡(TBT)对牡蛎细胞基因组DNA影响的RAPD分析 总被引：5，自引：0，他引：5
以僧帽牡蛎(Saccuostrea cucullata)为材料,取其鳃进行组织培养,同时对其进行7个浓度0,0．02,0．2,2,20,200,2000μg／L的三丁基锡(TBT)处理,提取鳃细胞基因组DAN。从38个随机引物中筛选出4个引物,对上述DNA样品进行利用RAPD-PCR扩增分析。结果表明。TBT处理的基因组DNA与对照组样品比较有一定差异,扩增条带总数均有所减少,随TBT处理浓度的不同,条带缺失或者条带深浅变化呈明显差异性,表明不同浓度TBT处理会对DNA造成不同程度的损伤。 相似文献
9.
光强和二氧化碳浓度变化对浒苔幼苗生长及生理的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
大气CO2浓度升高引起的海洋酸化如何在光变环境下影响大型海藻固碳量的问题,关系到未来海洋初级生产力的变化趋势。为研究大型海藻对CO2浓度升高和光强变化的响应,本文选取浒苔(Ulva prolifera)幼苗为实验材料,探讨其在不同光强下[80、260μmol/(m2·s)]和两种CO2浓度(正常CO2浓度:400μL/L和高CO2浓度:1 000μL/L)下的生理变化。研究发现,在正常CO2浓度、高光条件下,浒苔幼苗的生长最快,超氧化物特化酶(SOD)活性最高,而过氧化氢酶(CAT)活性在低光、高CO2处理下有最大值。光合色素含量和光系统Ⅱ的光化学效率在不同处理间没有显著性差异,但叶绿素a与类胡萝卜素的比值在低光正常CO2处理下有最大值。同时,高光高CO2处理下,浒苔幼苗的可溶性蛋白含量最低。 相似文献
10.
我国的养殖香鱼正面临着严重的香鱼格留虫（Glugea plecoglossi）感染。本研究联合运用环介导等温扩增技术（LAMP）和横向流动试纸条（LFD）的检测技术，建立了快速便捷地检测G. plecoglossi的LAMP-LFD方法。该方法以G. plecoglossi的β微管蛋白基因为检测靶标，在其保守区域设计并筛得6条特异性引物（其中上游内引物用生物素标记），进行LAMP反应，产物再与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的特异性探针杂交，在LFD上进行结果判断。结果表明，LAMP-LFD方法能够特异性地检出G. plecoglossi，对梅氏新贝尼登虫、刺激隐核虫、肝肠胞虫阳性的虾组织、派氏异尖线虫、内弯宫脂线虫、鳗弧菌香鱼分离株、杀香鱼假单胞菌，以及香鱼组织等的检测均呈阴性。优化后，LAMP的反应条件为65℃反应45min，与探针杂交的条件为65℃反应5min，加之5min的显色时间，整个检测时程为55min。利用该方法能够检测到2.0fg/μL的含β微管蛋白的质粒DNA，针对G. plecoglossi基因组DNA的检测灵敏度为14.0pg/μL；能够从感染强度达到100个虫体/克的香鱼肝组织中稳定地检测到虫体。该方法可在简单的恒温加热设备（如水浴锅）中完成核酸扩增和探针杂交，无需昂贵的仪器装置。综上，香鱼格留虫LAMP-LFD方法操作便捷、灵敏度高、特异性好、检测快速，而且设备依赖性低，完全适合于基层检测的需求。 相似文献
11.
果蔬表皮农药残留关乎食品安全问题。本文以苹果为研究对象,应用表面增强拉曼光谱(SERS)技术,结合高灵敏度、便携的纳米检测棒,检测果蔬中常用农药倍硫磷和多菌灵,研究农药残留衰减规律,并对比研究不同方法对农药残留的去除效果。研究表明,基于GMA-EDMA多孔材料和金纳米颗粒制备的纳米检测棒,对苹果表皮残留的倍硫磷和多菌灵的最低检测浓度分别达0.10和0.05 mg/L,在低浓度范围内特征峰强度与浓度成良好的线性关系。苹果表皮两种农药残留量随时间成e指数衰减,衰减为e-1的时间常数分别约为1~2 d和4~5 d。不同清洗剂(清水、盐水、小苏打水、果蔬洗涤剂)对农药残留的清洗效果不同,淡盐水可提高农药残留清洗效率,清水清洗需要延长清洗时间才能达到相同效果。研究结果表明,纳米检测棒能有效提高果蔬农药残留的检测灵敏度和检测效率,结合便携式拉曼系统,可实现果蔬农药与淡盐水残留的快速、现场检测。 相似文献
12.
Edwardsiella tarda is one of the most important emerging pathogens in the global aquaculture industries. As such, an accurate diagnosis and quantitative analytical methods are urgently needed for this bacterium. In this study, primers and a TaqMan probe specific to the conservative sequences of the 16S rRNA gene of E. tarda were designed. The concentration of primers and TaqMan probe were optimized to 200 nmol/L and 120 nmol/L, respectively. The detection sensitivity of the FQ-PCR assay was determined to be as low as five copies of the target sequence per reaction using the pGEM-16S rDNA recombinant plasmid as a template, which was 100 times more sensitive than conventional PCR. A standard curve by plotting the threshold cycle values （y） against the common logarithmic copies （log10 nc as x; nc is copy number） of pGEM-16S rDNA was generated. The results of intra-and inter-assay variability tests demonstrate that the established FQ-PCR method was highly reproducible. The assay was specific for E. tarda as it showed that there was no cross-reactivity to eight additional bacterial pathogen strains in aquaculture. Thus, the FQ-PCR assay has the potential for diagnostic purposes and for other applications, especially for the rapid detection and quantification of low-grade E. tarda infections. 相似文献
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PCR法制备地高辛标记探针斑点杂交
检测白斑综合症病毒(WSSV) 总被引：2，自引：0，他引：2
用PCR法成功制备了DIG标记探针，探针长度为547bp，探针的产量为21.6ng/μL。此探针与随机引物合成探针检测样品灵敏度相近。用此探针核酸斑点杂交法检测了54尾中国对虾。结果表明此探针在对白斑综合症病毒的检测、对虾暴发性流行病的诊断等方面具有很高的应用价值。 相似文献
14.
A better understanding of bacterioplankton community shifts following change in marine environments is critical to predict the marine ecosystem function. In order to get a snapshot of the microbial taxonomy profiling of a wide range marine area, a quick, convenient and low cost method would be favorable. In this study, we developed a 16S rRNA gene-based microarray using ARB software, which contained 447 probes targeting 160 families of marine bacteria. The specificity, sensitivity and quantitative capability of this microarray were assessed by single cloned16S rRNA genes. The reliability of this microarray was tested by eight environmental samples. The results showed that the microarray was specific, only 1.16% false results were detected in five single-clone hybridization tests. The microarray could detect DNA samples as few as 1 ng/μL and the signal intensity could reflect the relative abundance of the bacteria in the range of 1 ng/μL to 100 ng/μL of DNA concentration. Hybridization with environmental samples showed that it can discriminate bacterioplankton communities by sites and time. High throughput sequencing results from the eight samples confirmed the hybridization results. It indicated that this developed microarray could be used as a convenient tool to monitor the bacterioplankton community in marine environment. 相似文献
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通过迭代CFAR算法，本文发展了一种针对分块SAR图像的冰山检测方法。考虑到滑动窗口运算负担大、计算效率低，首先对SAR图像进行分块，以提取分块内的亮目标冰山。利用高斯模型表征后向散射系数的统计分布，冰山检测阈值可简单地表达为均值和方差的线性组合，将分块内像素逐个比对阈值以检测冰山。考虑到同一场景中尺寸变化大的冰山影响检测精度，以识别的冰山像素做种子执行区域生长，从而提取大尺寸的冰山。针对单个分块迭代上述处理，以降低高斯模型表征分块统计分布的误差，提高冰山检测精度。利用2013年11月22日和29日获取自极地海域的两景RADARSAT-2图像开展验证试验。结果表明，数量多、尺寸变化大并嵌入在海冰等极地常见情形下的冰山，能被文中方法有效识别，选取区域内正确率高达85%以上，且具有良好的运行效率。 相似文献
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HWANG Jinik PARK So Yun SUH Sung-Suk PARK Mirye LEE Sukchan LEE Taek-Kyun 《海洋学报(英文版)》2016,35(8):44-50
Viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) and marine birnavirus (MABV) are the causative pathogens for some of the most explosive epidemics of emerging viral diseases in many Asian countries, leading to huge economic losses in aquaculture. Rapid molecular detection for surveillance or diagnosis has been a critical component in reducing the prevalence of pathogen infection. The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of DNA is currently one of the most commonly used molecular diagnostic tools, as it is simple, quick, and easy to amplify target DNA under isothermal conditions. In the present study, a novel and highly specific LAMP assay for the sensitive and rapid detection of VHSV and MABV infection in fish was developed. Using a set of synthesized primers matching a specific region of the genome, the efficiency and specificity of the LAMP assay were optimized in terms of the reaction temperature and DNA polymerase concentration, as they are the main determinants of the sensitivity and specificity of the LAMP assay. In particular, we demonstrated that our assay could be applied to efficient detection of VHSV and MABV infection in the wild fish, Paralichthys olivaceus. Our results demonstrate the simplicity and convenience of this method for the detection of viral infection in aquatic organisms. 相似文献
17.
轮状病毒是引起婴幼儿急性腹泻的重要病原体之一,在水环境中存活时间长,导致人类感染的剂量低,因此寻求一种快速高效的定量检测海水中的轮状病毒方法势在必行。传统的细胞培养技术不但耗时,而且灵敏度低,现代分子生物学技术虽然克服了上述缺点,但是其感染性的信息无从获得。因此,本文建立了细胞培养结合实时定量PCR(ICC-qPCR)的方法,并于2010年冬季对渤海湾天津近岸重点海域表层海水中具有感染性的轮状病毒进行了定量调查。500 mL海水经浓缩,48 h细胞培养之后,用qPCR方法在7个海水样品中检测出3个样品具有感染性,其测定值范围为1.8×102copies～3.8×103copies,该海域感染性轮状病毒的含量为1～39 PFU/L。ICC-qPCR方法快速、灵敏,将细胞培养与实时定量PCR技术相结合,能对感染性病毒进行定量分析,因此有望在今后的水环境胃肠道病毒的监测中得到广泛应用。 相似文献
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锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 总被引：2，自引：0，他引：2
研究建立并完善了Taqman实时荧光定量PCR检测锦鲤疱疹病毒（KHV）的方法。首先通过选取KHV病毒TK基因的保守序列（GenBank AB182940）,利用PRIMER EXPRESS 2.0设计引物和探针。其中Taqman探针的5’端标记FAM,3’端标记TAMRA。然后利用梯度稀释的阳性样品克隆质粒进行定量PCR反应,制作标准曲线,得到病毒拷贝数与Ct值的关系为：Ct=-3.45 lgX＋42.73（相关系数R2=0.989）。通过试验检测得到实时荧光定量PCR对KHV的灵敏度为32个病毒核酸拷贝数,同时,设计的引物和探针对于鱼类细胞系和其它鱼类病毒没有扩增反应,表现出较好的特异性。实验结果表明,实时荧光定量PCR检测KHV的方法,具有特异性好、灵敏度高的特点,可以缩短检测时间,提高检测速度,非常适合口岸进出口检验检疫的要求。 相似文献
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在解析YOLOv4算法基础上,针对应用YOLOv4算法检测遥感影像桥梁目标任务中出现的训练耗时严重及精度较低缺陷,从算法训练过程和结构模块两方面进行优化:使用多尺度训练以及fp_16训练策略降低算法训练成本,并引入SE模块和CBAM模块两种注意力机制提升算法检测精度。消融实验结果表明:优化训练策略能够有效降低算法训练成本,同时提高目标检测精度;相比较CBAM模块,SE模块对算法训练成本增加较小却能收获显著的检测精度提升,优化训练策略并嵌入SE模块的算法,使高分桥梁数据集和DOTA桥梁数据集的平均准确率分别提升1.4%和3%。该优化算法兼具效率和精度优势,为桥梁目标检测难题提供有效解决方法。 相似文献
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采用单细胞凝胶电泳实验研究了不同浓度的Cu2+(10、50、100、500、1000、2500、5000μg/L)和不同粒径(0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0μm)、不同浓度(1、10、15、20、25 mg/mL)的聚苯乙烯微塑料对人单核细胞白血病(Human Acute Monocytic Leukemia,THP-1)细胞的DNA损伤效应,结果表明:单一污染时,Cu2+(≥50μg/L)对THP-1细胞的DNA损伤极显著(p<0.01)。而且,DNA损伤值随Cu2+浓度的增大而增加。2.0μm粒径的聚苯乙烯微塑料(10 mg/mL)对THP-1细胞产生明显的DNA损伤效应。复合污染作用下对THP-1细胞的DNA损伤效应,相比单一污染明显增强,而且DNA损伤值比单一污染的理论加和值高。本研究表明Cu2+和聚苯乙烯微塑料均对DNA产生损伤效应,显示一定的基因毒性,二者复合对损伤具有交互增强的作用。 相似文献