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1.
采用间歇产气试验方法对红树林淤泥中的混合菌群进行产氢菌群富集,并对混合产氢菌群发酵产氢过程中发酵液的pH值和氧化还原电位(ORP)的变化进行分析.此外,在产氢速率最高时段,发酵液中菌群经过常规的基因组提取,分别采用通用的梭菌属Fe-氢酶基因和16S rRNA基因引物进行PCR扩增,扩增产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析.结果发现产氢菌群中至少有6种,而Fe-氢酶基因只含有一种.将Fe-氢酶基因的扩增片段切胶纯化之后,经PCR重新扩增、纯化,克隆测序.NCBI序列比对结果表明,该片段序列与产气荚膜梭菌Fe-氢酶基因的序列相似性达99%.根据已知产气英膜梭菌Fe-氢酶基因序列设计引物,经两轮PCR扩增获得Fe-氢酶基因全序列.混合菌群中Fe-氢酶基因GenBank数据库的登录号为EU590683.此外,采用Bioedit和Mega2软件构建了Fe-氢酶的NJ系统进化树,结果表明该Fe-氢酶基因与产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)聚为一类.推测的氨基酸序列与产气英膜梭菌的相应序列相似性达97%-99%.PfamHMM结构域查找结果发现,此氢酶含有五个结构域,分别为1个2Fe-2S铁硫簇结合区域、2个4Fe-4S结合区域、Fe-氢酶大亚基和Fe-氢酶小亚基. 相似文献
2.
三角褐指藻磷酸甘油酸变位酶基因可能侧翼序列的筛选、克隆以及序列测定 总被引：2，自引：2，他引：2
采用RT PCR的方法从酵母中成功地得到了磷酸甘油酸变位酶的cDNA基因 ,分别用32 P和地高辛 ddUTP标记以用作探针。以32 P标记的探针筛选三角褐指藻基因组文库 ,获得了 4kb的阳性DNA片段 ;进一步分析发现 ,该 4kb片段的真正阳性区域是位于片段端部的30 6bp的序列 ,因此认为该序列为三角褐指藻磷酸甘油酸变位酶基因的侧翼部分。克隆该30 6bp的DNA片段 ,并且测定其序列。结果表明 ,该 30 6bp的DNA片段包含两个同向重复序列 ,每个重复序列的大小为 1 1 6bp ,在每个重复序列中均含有GGTTCAATGT区域 ,这与一般常见的真核基因 5′端的CAATbox有相似之处。 相似文献
3.
β-胡萝卜素酮化酶(BKT)是雨生红球藻虾青素合成途径中的关键酶。根据GenBank中所收录的雨生红球藻BKT的cDNA序列设计特异性引物,以高光照处理的雨生红球藻细胞的总RNA为模板,采用RT-PCR的方法克隆出了β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)。序列测定结果表明,bkt全长960bp编码320个氨基酸。克隆的bkt序列与GenBank收录的BKT的cDNA(AY603347)序列只相差一个碱基。并对其编码的氨基酸进行了二级结构的预测和疏水性分析。同时将所克隆的bkt构建入衣藻叶绿体表达载体p64Dbkt,为基因的进一步表达研究及探索其作用机制奠定了基础。 相似文献
4.
核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶(RubisCO)(EC4.1.139)是光合细菌通过卡尔文循环固定二氧化碳的关键酶。本文采用PCR方法,从沼泽红假单胞菌株No.9中克隆到RubisCO基因(cbbM)序列(该序列已提交GenBank,登录号:GU061327)。采用同源建模法,建立了该RubisCO蛋白的三维结构模型,预测其活性位点。将cbbM基因亚克隆到表达载体pTV118N上,构建表达质粒pTV-CBBM,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株BL21(DE3)/pTV-CBBM,该菌株经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE检测。采用气相色谱法测定破菌上清中的RubisCO酶活。结果表明:①cbbM基因编码461个氨基酸,与沼泽红假单胞菌株DCP3和DH1的RubisCO蛋白序列相似性分别为98%和99%;②推测沼泽红假单胞菌No.9中RubisCO蛋白的活性中心由Asn112、Lys192、Asp194、Glu195、His288、Arg289、His322、Gly424、Ser369、Gly370和Gly394等氨基酸残基组成;③重组蛋白分子量约为50kDa左右,与预测相符;④破菌上清中的RubisCO酶比活高于原始菌株中的酶活,说明目的基因在大肠杆菌中得到了有效表达。 相似文献
5.
综述了蓝藻中催化氢代谢反应的2种关键酶—固氮酶和氢化酶的生物学特征、分子基础及其编码基因和转录等最新研究进展。蓝藻在固氮细胞中的净产氢量是固氮酶和氢化酶(包括吸收氢化酶和双向氢化酶)综合作用的结果,但在非固氮情况下的产氢则主要是由双向氢化酶催化的。可通过有效利用基因工程技术对产氢相关酶基因进行改造,改进生物产氢系统。 相似文献
6.
哈维氏弧菌是水产病害中常见的致病菌.参照基因库上登录的弧菌鞭毛丝蛋白FlaA基因序列设计简并引物,PCR扩增哈维氏弧菌TS-628株的FlaA全基因,并克隆到pMD 18-T载体中测序,经序列分析该基因全长1 140 bp,编码379个氨基酸.与基因库中其他弧菌的同源基因序列比较显示,哈氏弧菌FlaA基因与霍乱弧菌FlaA基因的同源性最高(79.5%),该基因编码的多肽缺乏半胱氨酸,并在N-,C-两端的氨基酸序列较为保守,中间区域的变异较大.对该蛋白的氨基酸组成及空间结构进行了分析和预测,并推测该蛋白质的平均分子量为40.6 kDa.在该基因末端加上一段编码Flag短肽的核苷酸序列后克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得带哈氏弧菌鞭毛丝蛋白FlaA基因的真核表达重组质粒pcDNA-FlaA-tag,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础. 相似文献
7.
大菱鲆(Scophthalmus maximus)病原鳗利斯顿氏菌的鉴定 总被引：1，自引：1，他引：1
采用表观分类学及分子生物学方法,对从大菱鲆细菌性败血感染症的病(死)鱼中分离到的相应病原菌,进行了形态特征、理化特性等较系统的鉴定及代表菌株DNA中G Cmol%的测定;同时,择代表菌株进行了16SrRNA基因的分子鉴定,测定了16SrRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树。结果表明,所检30株菌均为利斯顿氏菌属(ListonellaMacDonellandColwell1986)的鳗利斯顿氏菌[L·anguillarum(Bergeman1909)MacDonellandColwell1986],择S010610-1株、S010610-3株及S010623-1株作为代表菌株进行的16SrRNA基因序列测定,不包括引物结合区,所扩增的16SrRNA基因序列长度,S010610-1株为1466bp(GenBank登录号:AY963630)、S010610-3株为1416bp(GenBank登录号:AY963631)、S010623-1株为1424bp(GenBank登录号:AY963632),与GenBank数据库中弧菌属细菌的同源性在97%—99%。 相似文献
8.
磷酸甘露糖变位酶(PMM)是褐藻胶和岩藻聚糖合成过程中的关键酶之一。本研究利用c DNA末端快速克隆(RACE)技术,获得2条海带PMM基因(Sjpmm1,Sjpmm2)序列。其中,Sjpmm1的开放阅读框(ORF)长759 bp,其编码的Sj PMM1为卤酸脱卤酶(HAD)超家族成员,含252个氨基酸,分子量约为28.51 k Da;而Sjpmm2的ORF长1866 bp,其编码的Sj PMM2属于磷酸己糖变位酶超家族的成员,含621个氨基酸,分子量约为66.49 k Da。海带PMM的二级结构均以?-螺旋为主。进化分析表明,Sjpmm1来自于原始真核生物,而Sjpmm2来源于质体的第一次内共生作用。实时定量PCR分析发现,海带受到高温或低温胁迫时,Sjpmm1和Sjpmm2转录水平上升,以合成岩藻聚糖抵抗环境影响。此外,利用p MAL-c5X载体对Sj PMM1进行体外表达,得到高浓度的可溶性融合蛋白,为后续的Sj PMM功能分析提供基础。 相似文献
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绿海龟α-actin 基因的cDNA 克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为探究绿海龟(Chelonia mydas)α-actin基因序列的相关信息,作者利用RT-PCR和RACE方法从绿海龟肌肉组织中获得了α-actin基因的cDNA全长序列,共1347bp(GenBank登录号为JX073650)。所得序列包含一个1134 bp的开放阅读框,编码由377个氨基酸组成的蛋白,该蛋白7~377位为Actin结构域,14~17位有一个糖基化位点,无信号肽;预测分子量为42.0 kDa,理论等电点为5.23。将编码区序列与GenBank上同源序列进行比对发现,核苷酸序列相似性均在85.4%以上,氨基酸序列相似性均在98.9%以上,说明α-actin基因作为编码蛋白是高度保守的。 相似文献
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为探究绿海龟（Chelonia mydas）α-actin基因序列的相关信息,利用RT-PCR和RACE方法从绿海龟肌肉组织中获得了α-actin基因的cDNA全长序列,共1347bp（GenBank登录号为JX073650）。所得序列包含一个1134bp的开放阅读框,编码由377个氨基酸组成的蛋白,该蛋白7-377位为Actin结构域,14-17位有一个糖基化位点,无信号肽;预测分子量为42.0kDa,理论等电点为5.23。将编码区序列与GenBank上同源序列进行比对发现,核苷酸序列相似性均在85.4%以上,氨基酸序列相似性均在98.9%以上,说明α-actin基因作为编码蛋白是高度保守的。系统发育分析表明,绿海龟α-actin基因与两栖类亲缘关系较近,而与鱼类亲缘关系较远。本研究丰富了actin基因的资料库,为进一步研究相关基因的表达及功能奠定了基础。 相似文献
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在保守序列高度相似的细菌鉴定中,单独使用16S rDNA/RNA序列进行比对和构建进化树通常无法准确鉴定到种,需要增加测序基因数并对多基因进行分析。为实现快速鉴定,课题组对16S与gyrB基因联合建树的方法进行了研究,将海洋来源的一株杆菌,分别用通用引物扩增16S和gyrB基因并测序,在GeneBank进行序列比对后,选择各菌种保藏中心16S和gyrB基因均相似的菌株,取16S和gyrB基因序列,采用Paup*4.0构建进化树。使用16S与gyrB拼接序列构建的进化树中属于同一种的菌株均很好的聚合在一枝,种间分枝自展值均高于98,分类结构准确,筛选得到的杆菌与地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)聚合在一枝,自展值为100,鉴定为地衣芽胞杆菌。经生理生化试验验证,该菌株与地衣芽胞杆菌特征完全一致,使用16S和gyrB基因联合建树得到的鉴定结果准确且快速简便。 相似文献
13.
采用常规表观生物学特性及16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索与系统发育学分析等方法,对分离自江苏连云港某育苗场的大批死亡日本对虾蚤状幼体的优势生长菌进行了综合鉴定。结果表明,其形态和生理生化特征与弧菌属的需钠弧菌相近;16S rRNA、gyrB及rpoA基因同源性检索也均与需钠弧菌相似性最高,分别为98%、89%和95%,且三种基因的NJ系统发育树也均与需钠弧菌聚为一个分支;分离菌的致病性试验表明其半数致死量LD50为1.8×106CFU/ml。综合分离菌的致病性、形态与生理生化特征及基因同源性与系统发育分析结果,认为引起日本对虾蚤状幼体大批死亡的病原为需钠弧菌。基于gyrB基因序列设计1套LAMP特异性引物,建立了需钠弧菌的快速特异性检测方法,可用于由需钠弧菌引起的水产动物疾病的诊断及分子流行病学的调查研究。 相似文献
14.
以桐花树(Aegiceras corniculatum (L.) Blanco)叶为材料, 采用同源PCR克隆策略, 扩增桐花树多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase, PPO)铜结合区之间的cDNA序列.该序列长度597 bp (Genbank accession No. GQ404509), 编码了一段由199 个氨基酸残基组成的多酚氧化酶保守区片段.桐花树PPO保守区片段具有PPO铜结合区A(CuA)的特征信号序列Hnswl.FFpFHRyyLyffE.同源比对表明, 该序列与GenBank上其他已有的植物多酚氧化酶氨基酸序列的同源性都在65%以上. 相似文献
15.
New PCR primers (N=18) were designed for the isolation of complete SSU to LSU rDNA sequences from the dinoflagellateAlexandrium tamarense. Standard PCR, employing each primer set selected for amplifications of less than 1.5 kb, successfully amplified the expected
rDNA regions of A. tamarense (Korean isolate, HY970328M). Complete SSU, LSU rDNAs and ITS sequences, including 5.8S rDNA,
were recorded at 1,800 bp, 520 bp and 3,393 bp, respectively. The LSU rDNA sequence was the first report inAlexandrium genus. No intron was found in the LSU rRNA coding region. Twelve D-domains within the LSU rDNA were put together into 1,879 bp
(44.4% G+C), and cores into 1514 bp (42.8% G+C). The core sequence was significantly different (0.0867 of genetic distance,
91% sequence similarity) in comparison withProrocentrum micans (GenBank access. no. X16108). The D2 region was the longest in length (300 bp) and highly variable among the 12 D-domains.
In a phylogenetic analysis using complete LSU rDNA sequences of a variety of phytoplankton,A tamarense was clearly separated with high resolution against other species. The result suggests that the sequence may resolve the taxonomic
ambiguities ofAlexandrium genus, particularly of the tamarensis complex. 相似文献
16.
VASA蛋白属于DEAD-box家族蛋白,是一种RNA解旋酶,在生殖细胞的分化中具有重要作用。本研究从脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢中克隆得到vasa基因cDNA全长(将其命名为Ec-vasa),Ec-vasa序列长度为2516bp,开放阅读框(ORF)长度为1800bp,编码600个氨基酸,具有DEAD-box家族蛋白的8个高度保守的结构域,与日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的同源性最高(80%)。半定量RT-PCR结果显示,Ec-vasa在卵巢组织中特异表达,在肌肉、肝胰腺、心脏和鳃等组织中均未检测到表达。荧光定量结果显示,Ec-vasa在卵巢发育Ⅰ期具有较高表达量,随着卵巢的发育,表达量逐渐降低,在第Ⅳ期达到最低水平。结果表明,Ec-vasa基因可能在脊尾白虾卵巢的早期分化和卵子发生过程中起重要作用。 相似文献
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热休克蛋白70(HSP70)是生物体内一种重要的机体与细胞保护性蛋白。本文利用RT-PCR以及RACE技术首次克隆获得太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)HSP70简称Ep.HSP70 c DNA的全长序列,序列全长为2252bp(KY807149),开放阅读框(ORF)长1947bp,编码649个氨基酸,5′端99bp,3’端206bp;预测蛋白分子量为70.81k Da,等电点为5.16,为一种亲水性蛋白,不存在信号肽及跨膜区,含有丰富的α螺旋结构(37.60%),β折叠(18.80%)。同源氨基酸序列比对发现,与其他甲壳动物的同源基因保守性较高,尤其是HSP70家族典型的结构位点序列在甲壳类动物中具有高度保守性。系统进化分析表明,太平洋真宽水蚤和安氏伪镖水蚤(Pseudodiaptomus annandalei)进化关系最近;桡足类种内同源性要高于虾蟹类,与虾类同源性高于蟹类。荧光定量数据分析表明,不同浓度铜、镉、锌胁迫下太平洋真宽水蚤HSP70基因表达水平具有显著的时间效应与浓度效应的特征,三种金属对Ep.HSP70抑制效应呈现CuCdZn的趋势。Ep.HSP70基因的成功克隆及金属胁迫下的表达分析为深入研究HSP70蛋白生物学功能具有重要意义。 相似文献
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为探讨虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)性别决定和雌雄同体形成的分子机制,利用兼并引物,以闭壳肌基因组DNA为实验材料,扩增和克隆了虾夷扇贝Dmrt基因的DM结构域,雌性、雄性和雌雄同体3种性别共获得2个具有不同DM序列的克隆,序列长度均为141bp,分别命名为Py Dmrt3和Py Dmrt4。Py Dmrt3在3种性别类型中均有克隆,而雄性中还克隆出Py Dmrt4。结果表明,在虾夷扇贝不同性别中,Dmrt基因家族的成员可能会有不同;雄性py Dmrt3的DM结构域核苷酸和氨基酸变异频率高,其次是雌雄同体,雌性的较保守,与其他软体动物DM结构域比对,该基因家族在进化上仍然高度保守,由此推测,部分雄性可能是发生了性逆转的雌雄同体,这种较高的变异性可能也是雌雄同体的一个特点,Py Dmrt4可能参与调控雄性性别的形成。 相似文献
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Geret F Manduzio H Company R Leboulenger F Bebianno MJ Danger JM 《Marine environmental research》2004,58(2-5):619-623
The potential of the first line of the active oxygen-scavenging system, partial cDNA encoding Cu/Zn superoxide dismutase (SOD) was isolated in three aquatic mollusc species: Ruditapes decussatus (marine clam), Dreissena polymorpha (continental water mussel) and Bathymodiolus azoricus (hydrothermal vent mussel). These SOD cDNA fragments were amplified by PCR with degenerate oligonucleotide primers derived from the amino acid sequence conserved in the Cu/Zn-SOD from several other organisms. A partial cDNA of CuZn-SOD was obtained for R. decussates (510 bp), D. polymorpha (510 bp) and B. azoricus (195 bp). The deduced amino acid sequence showed high similarity among the three mollusc species (57-63%) and among other species (50-65%). The residues involved in coordinating copper (His-47, 49, 64, 121) and zinc (His-64, 72, 81 and Asp-84) were well conserved among the three Cu/Zn-SOD sequences. 相似文献
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根据已发表的最小弧菌热不稳定型溶血素（heat-labile hemolysin）基因核苷酸序列，设计和合成一对特异性引物，以最小弧菌96-6-3的基因组DNA为模板，PCR扩增得到热不稳定型溶血素基因片段，克隆到质粒载体pMD-18T中进行测序和分析．其结果表明扩增的热不稳定型溶血素基因片段与已发表的最小弧菌热不稳定型溶血素的同源性高达98％，扩增片段编码由446个氨基酸组成的多肽，推测分子量为50200．软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性，可作为基因工程疫苗的候选基因片段． 相似文献