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1.
为了研究PHB2蛋白的生物学活性及后续抗体的制备,作者以前期构建的p MD18-T-Lm-PHB2质粒为模板,PCR扩增Lm-PHB2基因全长CDS区,PCR产物经Hind III和Eco R I双酶切后连接至表达载体p ET-32a,构建重组质粒p ET-32a-Lm-PHB2。将鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta Blue,经IPTG诱导表达后,表达产物通过SDS-PAGE和Western blotting进行检测,利用镍柱亲和层析纯化得到纯度较高的目的蛋白r Lm-PHB2。结果表明,经PCR、双酶切和测序鉴定,所构建的重组质粒p ET-32a-Lm-PHB2序列正确,表达产物存在于裂解菌液的上清和沉淀中,经SDS-PAGE和Western blotting证实在约47 ku处有目的蛋白r Lm-PHB2的表达条带。本研究构建了重组七鳃鳗(Lampetra japonica)PHB2蛋白的原核表达载体,并大量表达和纯化目的蛋白,为该蛋白后续的抗体制备及生物活性研究奠定了基础。 相似文献
2.
大黄鱼β2-微球蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的重组表达 总被引：1，自引：0，他引：1
主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）是一类高度多态的基因群，它广泛分布于各种脊椎动物体内，在启动特异性免疫应答中起关键作用．MHC根据结构分为Ⅰ型和Ⅱ型两种．β2-微球蛋白（β2mcroglobulin，β2m）是MHCI型分子的轻链．本文根据大黄鱼β2m的表达序列标签（expressed sequence tags，EST）序列设计合成了特异性引物，利用RT—PCR技术从大黄鱼脾脏组织中克隆了β2m基因（Pscr-β2m）；构建了合β2m因的原核表达载体（pGEX4T-2-β2m，在0．1mmol／dm^3IPTG诱导下重组β2m得到了表达；采用Sepharose 4B亲合层析纯化目的蛋白并制备了抗体；Western—blotting分析证实了该抗体具有与天然大黄鱼脾脏组织中β2m蛋白反应的特性．这些结果为进一步研究鱼类β2m构与功能的关系，以及制备MHCI类分子四聚体奠定基础． 相似文献
3.
根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)生长激素(GH)基因的c DNA全长序列设计引物克隆得到其全长552个碱基成熟肽序列。利用RT-PCR方法将扩增片段克隆到原核表达载体p ET-28a上,实现了GH成熟肽在大肠杆菌BL21(DE3)中的融合表达。融合蛋白分子量为26 k Da,在IPTG诱导4h时目的蛋白表达量最高,占细菌总蛋白的41.5%,主要以包涵体形式存在。Western-blotting分析表明GH融合蛋白可特异性地被6×His抗体识别。诱导表达后的菌液沉淀经纯化和复性后,获得大小为26 k Da的纯化GH融合蛋白。以ELISA方法检测纯化后的GH融合蛋白显示其具有免疫学活性。本研究为认识半滑舌鳎生长轴的调控机制提供了基础资料。 相似文献
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精氨酸激酶是调节能量代谢的重要酶类,在无脊椎动物体内能量平衡过程中起重要作用。利用PCR扩增技术,从白肛海地瓜的cDNA文库中克隆得到精氨酸激酶(arginine kinase)基因,其全长为2139bp,包括5′非翻译区(5’-UTR)序列92bp,3′端非翻译区(3’-UTR)序列934bp和1113bp的ORF,编码371个氨基酸,预测分子量大小和等电点分别为42.32kDa和7.19。构建了精氨酸激酶原核表达质粒并转化表达菌株,经IPTG诱导表达后,获得了与预期的分子量大小一致的表达产物。利用该目的蛋白制备了白肛海地瓜精氨酸激酶的特异性多克隆抗体,经Western blot证明该蛋白为精氨酸激酶。 相似文献
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中国对虾细胞色素P450基因CYP4原核表达条件优化 总被引：1，自引：0，他引：1
根据克隆得到的中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）CYP4基因开放阅读框设计引物,构建了中国对虾CYP4基因原核表达载体p28a-CYP4,并对重组菌株Rosetta／28a-CYP4的原核表达条件进行了优化。结果表明：p28a—CYP4转化Rosetta后可实现CYP4基因的原核表达,SDS—PAGE分析显示其在56．0kDa处有显著诱导条带;通过对诱导温度、IPTG浓度、诱导时机（OD600）及诱导时间的优化表明,重组菌株Rosetta／p28a-CYP4的最佳诱导温度为37℃,最佳IPTG浓度为1．2mmol／L,最佳诱导时机及诱导时间分别为0．59和6h。 相似文献
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神经肽Y(Neuropeptide Y,NPY)被普遍认为是一种重要的促食因子,在调节鱼类的摄食行为方面起着至关重要的作用。为进一步研究牙鲆NPY蛋白的生物学功能,作者克隆了牙鲆NPY成熟肽序列(m-NPY)及含有信号肽的全长序列(f-NPY),利用原核表达系统分别进行体外重组表达,筛选出诱导剂IPTG最佳诱导浓度为0.8 mmol/L及最佳诱导时间3 h;此外,根据牙鲆NPY第49-64位氨基酸序列制备了多克隆抗体并通过Western blot验证该多抗能够有效检验重组NPY及牙鲆体内NPY的表达。研究结果为研究重组牙鲆NPY蛋白在牙鲆水产养殖产业中的应用及检测提供了依据。 相似文献
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转录因子Sp是一类广泛存在的锌指蛋白超家族成员,可与某些基因的上游调控序列结合,参与基因的转录调控。本研究采用同源克隆和RACE技术,获得单环刺螠的Sp8的全长cDNA,该序列长1 913bp,开放阅读框1 521bp,编码506个氨基酸;将其开放阅读框cDNA克隆到原核表达载体pET28a中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在37℃条件下,经1mmol/L IPTG诱导表达4h,获得以包涵体形式存在的重组蛋白pET28a-SP,使用8mol/L尿素溶解包涵体,并通过镍离子金属螯合柱纯化获得重组蛋白,SDS-PAGE分析该蛋白的分子量约为50kD。Sp8蛋白体外表达的成功将为研究单环刺螠相关基因的转录调控打下基础。 相似文献
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本研究利用SMART-RACE技术克隆了大菱鲆SmPDIA3基因。SmPDIA3基因cDNA序列全长2083bp，包括1479bp的开放阅读框，编码492个氨基酸，GenBank登录号：MG765516。组织表达分析发现：SmPDIA3基因在肠、鳃、肝脏等组织中均有表达，其中在肝脏中表达量最高，脑中最低。进一步研究了温度胁迫后SmPDIA3基因在肠和肝脏组织中的表达变化规律，发现随着胁迫温度的升高，SmPDIA3基因的相对表达量总体上升，并在28℃时达到最大。利用原核表达技术，构建了pET-28a-PDIA3原核表达载体，IPTG诱导后融合蛋白主要在上清中表达。将上清中的蛋白分离纯化后，利用Western blot技术验证了目的蛋白的准确性。将纯化后的目的蛋白浓缩后，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测得蛋白浓度为243.18μg/mL。最后设计变性溶菌酶的复性实验，验证了SmPDIA3蛋白具有分子伴侣功能，能够辅助变性蛋白的正确折叠。 相似文献
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将青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)肌球蛋白重链基因片段亚克隆到pET-30a质粒,构建出重组表达载体并转化入大肠杆菌Escherichia coli BL21中.经SDS-PAGE和Western杂交检测表明,在IPTG诱导下含有重组载体的菌株可表达分子质量约30 ku的融合蛋白.诱导条件优化实验结果显示,该菌株经0.2 mmol/L IPTG诱导1 h就可大量表达此蛋白.可溶性实验确认该重组蛋白是可溶性蛋白.本研究为文昌鱼肌球蛋白重链特异性抗体的制备奠定了基础. 相似文献
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草鱼出血病病毒VP7蛋白基因的人工合成与原核表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank已发表的GCRVVP7蛋白基因序列,设计合成2条特异性引物和19条搭桥引物,通过搭桥PCR人工合成带有3处变异碱基的GCRVVP7蛋白基因整个编码框,经过酶切、连接、PCR鉴定和测序鉴定克隆到原核表达载体pColdTF中,并转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达和表达产物的SDS-PAGE、Western-blotting分析、纯化以及反应原性的iELISA检测。结果表明,成功人工合成了长831bp的GCRV VP7蛋白基因编码框和构建了VP7蛋白基因的重组质粒pCold TF-VP7,pColdTF-VP7转化菌经IPTG(1mmol/L)诱导3—4h即可获得特异性蛋白VP7重组蛋白的高效表达,VP7重组蛋白相对分子量大小约为73.9ku,与预期大小相符,且与鼠抗GCRV血清有良好反应原性。 相似文献
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肌肉生长抑制素抑制动物肌肉的生长发育.根据本实验室克隆的大黄鱼（Pseudosciaena cro-cea）肌肉生长抑制素（MSTN）基因编码序列设计引物,用RT-PCR扩增目的片段,构建MSTN-pET-28 a重组表达质粒,将其转化到大肠杆菌BL21上并用1.0 mmol/dm3IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测该目的蛋白大小约为44 kDa,与理论值大小符合.用0.25 mol/dm3KCl染色后从凝胶中切取该蛋白且回收.该回收蛋白与弗氏佐剂等量混合后注射ICR小鼠制备多克隆抗体,并用Westernblot检测该抗体.免疫印迹结果在44 kDa的位置上出现棕色条带,表明大黄鱼肌肉生长抑制素的多克隆抗体制备成功.这为今后对肌肉生长抑制素功能的研究奠定了基础. 相似文献
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团头鲂(Megalobrama amblycephala)两种热休克蛋白 70(HSP70s)的原核表达、纯化及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
采用PCR方法扩增团头鲂组成型HSC70和诱导型HSP70基因完整的编码区片段,并分别克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),用1mmol/L IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达。采用Ni-NTA His Bind Resins亲和层析和DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析对目的蛋白进行纯化,并进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果表明,成功构建了团头鲂两种重组表达质粒pET-22b(+)/Ma-HSC70和pET-22b(+)/Ma-HSP70,表达融合蛋白的相对分子量均约为72kDa,并能与兔抗人HSP70多抗进行特异性结合,这两种HSP70s融合蛋白经纯化后的纯度均达到95%以上。本实验选择融合蛋白Ma-HSC70在25℃和Ma-HSP70在30℃下分别诱导7h作为可溶性表达的最佳条件。 相似文献
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鲨肝刺激物质类似物基因在大肠杆菌中的表达与产物活性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
构建了鲨肝刺激物质类似物基因片段的原核表达载体质粒 (pET-sHSS) ,转化大肠杆菌后通过IPTG诱导获得原核表达产物 ,并利用凝胶层析方法对表达产物进行了分离纯化 ;进一步利用MTT比色法研究了该重组产物对肝癌细胞株SMMC -7721的增殖影响。结果表明 ,在1mmol/L的IPTG的诱导下 ,鲨肝刺激物质类似物基因片段在大肠杆菌BL21菌株中获得表达 ,表达产物的相对分子质量大小约为17500u,占菌体可溶性蛋白总量的38%左右 ;纯化后的产物在低浓度下 (<50ng/L)具有明显刺激SMMC7721细胞株增殖的活性 ,高浓度下 (>100ng/L)则明显抑制该肿瘤细胞株的生长 ,与天然鲨肝刺激物质的生物活性类似 相似文献
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中国对虾素在大肠杆菌(Escherichia coli)中的重组表达 总被引：3，自引：0，他引：3
中国对虾素是从中国对虾血细胞中克隆得到的一种抗菌肽。为了进一步研究中国对虾素(CHP)的功能并为制备特异性抗体作准备，采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法，进行了对虾素原核表达的研究。根据从中国对虾血细胞中克隆得到的对虾素基因设计特异性引物扩增中国对虾素成熟肽基因(CHP)，插入原核表达载体pGEX-4T-1中，在E．coli BL21表达融合蛋白GST-CHP．结果表明，不同表达菌株的融合蛋白表达量为30％—34％，同一菌株在诱导5h后能达到最高表达量。利用GST亲和层析纯化融合蛋白，将融合蛋白用凝血酶裂解以得到CHP，其分子量约为5．6kDa，N-端测序结果与期望的成熟对虾肽序列一致。用液体生长抑制方法检测活性，表明重组GST-CHP蛋白及CHP均表现出对大肠杆菌的抑菌活性。 相似文献
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本研究克隆和表达了刺参原肌球蛋白(Tropomyosin,TRP)基因,进一步研究刺参再生过程中重要分子的功能.结果表明,TRP基因序列总长为1203bp,5 ′非翻译区为105bp,3 ′非翻译区为240bp,该序列包含一个855bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码284个氨基酸,分子量为33.27kDa,等电点为4.56.利用Escherichia coli对TRP进行了体外重组表达,在1mmol/L IPTG和37℃条件下诱导,能产生分子质量约为38kDa的重组蛋白,Western blot证明重组TRP与鼠抗刺参原肌球蛋白的多克隆抗体能特异性结合. 相似文献
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GATA家族是经典的转录因子家族,因其能特异性的与核苷酸序列T/A(GATA)A/G结合而得名。前期研究在单环刺螠(Urechis unicinctus)中筛选到GATA家族成员GATA B2与硫代谢关键酶硫醌氧化还原酶(Sulfide quinone oxidoreductase,sqr)启动子高转录活性区相互作用。为了进一步研究其是否参与硫化物代谢过程,本文鉴定了单环刺螠GATA B2基因(UuGATA B2),并分析其在成体各组织和硫化物暴露后的表达特征。结果显示:单环刺螠GATA B2的ORF全长为1788 bp,编码585个氨基酸;该氨基酸序列包含2个GATA家族保守的锌指结构域;系统进化分析显示UuGATA B2先与小头虫的GATA B2聚类,再与其它GATA4/5/6亚家族成员聚类。随后制备UuGATA B2多克隆抗体,利用Western blotting检测其在单环刺螠成体不同组织中的表达水平,结果显示其在体壁中的蛋白表达水平最高,中肠次之,后肠和肛门囊表达量较低,体腔液最低。由于sqr在硫化物暴露后的后肠中表达量最高,进一步对单环刺螠暴露在150μmol/L硫化物环境时后肠中UuGATA B2的表达进行了检测,发现其显著的响应硫化物胁迫,并在暴露12 h时含量达到最高,是对照组的2.32倍,表明UuGATA B2参与了单环刺螠硫化物应激过程。本文首次报道了GATA B2在硫化物应激中的表达特征,为后续深入探讨GATA家族在硫化物应激中的作用提供了基础数据。 相似文献
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Bcl-xL是Bcl-2家族中一类重要的抗凋亡因子,其功能主要是抑制细胞凋亡、促进肿瘤发生。为了探知Bcl-xL在生物硫化物应激中的作用,本实验以耐硫生物单环刺螠(Urechis unicinctus)为研究对象,RACE扩增获得一个长度为1 426 bp的单环刺螠Bcl-xL全长c DNA序列,推导的氨基酸序列包含Bcl-xL4个保守的BH结构域和1个跨膜区域。使用该c DNA的完整开放阅读框序列,构建了原核表达载体p ET28a-Bcl-xL,体外诱导表达该重组蛋白;镍柱纯化得到纯度为90%的纯化蛋白,并制备多克隆抗体。Western blotting结果显示:单环刺螠暴露于50μmol/L硫化物中2 h-24 h内其呼吸肠中Bcl-xL含量显著增加(P0.05),然而在150μmol/L硫化物中48 h-72 h内其呼吸肠Bcl-xL含量显著降低(P0.05),暗示Bcl-xL抑制细胞凋亡途径在单环刺螠应对低浓度硫化物暴露时发挥作用,而在高浓度硫化物暴露下Bcl-xL不能发挥抑制细胞凋亡的作用。 相似文献
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采用PCR扩增、构建重组高效表达载体的方法,进行了牙鲆多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的克隆、原核表达研究,并利用SDS-PAGE、western-blot及ELISA方法对纯化的重组蛋白特性进行了分析。结果表明,PCR扩增出pIgR开放阅读框(ORF)基因全长为1005 bp,所构建的pET-32(a)-pIgR重组质粒经PCR和双酶切鉴定含有ORF全长基因。SDS-PAGE结果表明,表达的目的蛋白相对分子质量为58 kDa,与理论预期值一致,IPTG诱导6h后表达量趋于稳定,经亲和层析纯化得到高纯度的重组蛋白。Western-blot结果表明,重组pIgR能够与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应;ELISA结果表明重组pIgR能够与牙鲆IgM发生特异性结合。本研究获得了纯化的重组pIgR,证明其具有IgM结合活性,为下一步研究牙鲆pIgR的转运机制及在黏膜免疫防御中的作用机理提供了分子基础。 相似文献
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对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒衣壳蛋白基因的克隆表达及抗体制备 总被引：2，自引：0，他引：2
本文根据GenBank登录的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的全基因组序列(NC-002190),设计出主要结构蛋白基因的相应引物,从厦门发病的对虾中,提取DNA,以此为模板,利用PCR扩增目的基因.再将目的基因分别与pGEX-6p1载体和pET-28a载体连接,构建重组表达载体pGEX-Ⅳ、pET-Ⅳ,重组子经酶切和测序鉴定后导入表达型大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测,大小约为62KDa和41KDa,与预测大小一致.将pET-Ⅳ表达重组蛋白经纯化,免疫小鼠,Western免疫印迹反应结果表明其抗体均可与pGEX-Ⅳ和pET-Ⅳ表达的蛋白发生特异性反应.本研究的结果为对虾IHHNV的快速检测及其免疫提供了研究基础. 相似文献