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皱纹盘鲍(Haliotis discushannai Ino)胚胎RNA分离和cDNA文库构建 总被引：2，自引：0，他引：2
从皱纹盘鲍胚胎样本中分离RNA并构建了cDNA文库。分别收集孵化8、10和12h的皱纹盘鲍胚胎,用抽滤除菌的海水反复悬浮胚胎,将这3个发育阶段的胚胎样本等量混合后用TRIZOL试剂提取总RNA,将提取物用酚氯仿异戊醇再抽提2次,分离获得高质量的总RNA。从总RNA中分离mRNA,构建了皱纹盘鲍混合胚胎的cDNA文库,未扩增胚胎文库的滴度为5.0×106pfu/ml,重组率为94.12%,插入片段均大于400bp,70.6%克隆的插入片段分布在1000—1500bp之间,扩增后的文库滴度为3.06×109pfu/ml。 相似文献
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为构建南极冰藻Chlamydomonassp.ICE-L的cDNA文库,提取对数生长期南极冰藻ICE-L的总RNA,以此为模板,通过PowerScript逆转录酶逆转录合成第一链cDNA;再以第一链cDNA产物为模板,用LD-PCR合成第二链cDNA。该cDNA产物经分级分离转入大肠杆菌中,即获得南极冰藻ICE-L的cDNA原始文库,其滴度为1.6×106cfu/mL。扩增后的cDNA文库的滴度为1.0×1010cfu/mL。用PCR方法测得文库的重组率大于97%,插入cDNA的长度为0.5~1.8 kb,0.9 kb以上插入片段占50%以上。取适量扩增文库稀释并铺平板,挑取72个独立菌落,对其中22个独立菌落所插入的cDNA进行测序,克隆到了一个具有5′和3′非编码区的40S ribosomalprotein S5全长基因序列,GenBank收录号为AM167929。 相似文献
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副溶血弧菌感染的九孔鲍血细胞均一化全长cDNA文库的构建 总被引：4，自引：0，他引：4
采用Trizol试剂提取副溶血弧菌感染的九孔鲍血细胞的总RNA,经Oligotex纯化得到mRNA.根据SMART技术原理合成双链cDNA.双链cDNA采用双链特异核酸酶进行cDNA的均一化,构建成九孔鲍血细胞的均一化全长cDNA文库.原始文库的库容为3.4×106 cfu/cm3,重组率为92.3%,扩增后文库的滴度为2.6×1011 cfu/cm3以上.从文库中随机挑取897个克隆,测序获得高质量ESTs814条,其中有23条Contigs; 762条Singlets,Unigenes共785条,冗余率只有3.56%.以上结果说明所构建的文库质量好,完全可以满足后续基因克隆和表达序列标签测序工作的需要. 相似文献
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以3种不同盐度处理的大叶藻为材料,采用RNA转录本5’末端转换机制(SMART)构建了大叶藻叶片全长cDNA文库,原始文库滴度为8.675×106pfu/mL,重组率为97.19%,插入片段平均长度大于800bp,扩增后的文库滴度达到1.03×109pfu/mL。将部分原始λ噬菌体cDNA文库转化成质粒cDNA文库,PCR检测结果显示文库插入片段集中在750～2000bp之间。随机选取20个单克隆进行测序,其中13条序列包含完整的开放阅读框。结果表明所构建文库容量大,全长比例高,为深入开展大叶藻功能基因研究奠定了基础。 相似文献
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中国对虾6种组织cDNA文库的构建 总被引：13，自引：0，他引：13
以中国对虾血液、眼柄、卵巢、雌虾头胸部、雄虾头胸部和三倍体对虾头胸部组织为材料,采用异硫氰酸胍-酸酚法提取总RNA;用磁珠法纯化mRNA;用Uni ZAP cDNA合成试剂盒合成双链cDNA并进行修饰,将cDNA定向连接在UniZAP载体上;经Gigapack Gold Package包装试剂盒包装成为噬菌体颗粒,转染宿主XL1 Blue MRF’菌株细胞,形成初级文库.初级文库经转染进一步扩增,形成稳定的cDNA文库.6个文库的库容在0.2×106~1.3×106之间,重组率都超过90%.从各文库随机取出6~10个清晰的噬菌斑进行PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测,其插入片段长度为500~2500bp.由初步功能基因克隆获得阳性结果.多项指标表明,所构建的对虾cDNA文库质量较高,为进一步筛选目的基因、EST测序和制作基因芯片提供了有效的工具. 相似文献
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雨生红球藻cDNA表达文库的构建与初步分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了筛选雨生红球藻虾青素合成过程中的关键酶基因的反式调节因子基因,以雨生红球藻的绿细胞为材料,提取了高质量的总RNA,并分离纯化了mRNA,经过反转录后的得到cDNA,构建了以λ-ZAPExpress为载体的表达型cDNA文库。经检测,所构建的文库的滴度为5.1×105,重组率为100%。用PCR方法对文库的质量进行了鉴定,文库的平均插入片断的大小为1.7kb。雨生红球藻cDNA表达文库的构建为研究虾青素的代谢工程奠定了基础。 相似文献
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龙须菜四分孢子体cDNA文库的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究不同世代和性别基因表达谱的差异 ,本文构建了龙须菜 (Gracilarialemaneiformis)四分孢子体的 c DNA文库。总 RNA提取使用 RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen) ,c DNA文库构建使用 SMART c DNA Library Construction Kit(Clontech) ,包装蛋白购自 Promega公司。该c DNA文库含有 1 .2 8× 1 0 6个克隆 ,扩增文库的滴度是 1 .98× 1 0 9pfu/ m L,重组频率是 85.0 % ,插入片段几乎全部集中在 50 0～ 1 50 0 bp之间 相似文献
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利用淘选噬菌体展示文库的方法,获取中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的免疫相关基因.首先用中国明对虾的血细胞mRNA构建了其T7噬菌体展示文库,文库滴度达到1.1×1011pfu/cm3,然后用不同的配体(脂多糖/几丁质/不同的细菌)进行文库淘选.淘选3轮后随机挑取数个噬菌斑,用T7 select 10-3b载体引物扩增插入片段,将不同长度的片段克隆入pMD 18-T载体后进行测序.把基因序列在GenBank数据库进行BLAST搜索比对,同时在ExPASy进行编码蛋白质的结构和性质的预测.经不同配体淘选,获得了16个基因片段,其中围食膜蛋白、蛋白质精氨酸N端转甲基酶、血小板反应素、RNA结合蛋白、核自身免疫精蛋白等基因,首次在中国明对虾中发现. 相似文献
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大黄鱼肌肉组织cDNA全长文库的构建及EST分析 总被引：1，自引：0，他引：1
以大黄鱼肌肉组织为材料,利用Creator Smart cDNA Library Construction Kit构建了大黄鱼肌肉组织的全长cDNA文库.文库质量分析表明：cDNA文库容量不低于1.68×106cfu/mm3,重组率达96%,插入片断的平均长度大于1 000bp.随机挑取512个cDNA克隆进行5’端测序,其中430条ESTs的长度大于100bp;并初步拼接得到了230个单基因簇（unigene）,其中包括58个重叠群（contigs）,172个单拷贝ESTs（singletons）,冗余度为46.51%.经检索,35个ESTs在BLASTx上无明显的同源性（E值≤1.00×10-10）,为新基因.195个ESTs与已报道的基因有较高的同源性;其中与能量相关基因的ESTs丰度最高,占总数的20.00%.蛋白质合成、细胞骨架和信号传导次之,比例分别为13.48%、12.17%、10.00%,其中包括高迁移率族蛋白B1、瘦素受体、β1-热激蛋白等.这些EST数据为进一步筛选和克隆大黄鱼肌肉特异性表达基因提供了平台. 相似文献
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在鳗弧菌侵染下,利用SMART方法构建了青蛤的cDNA文库,并采用高通量测序方法和BLASTX比对筛选出ESTs及免疫相关因子的基因.结果表明,所构建的cDNA文库的库容量为1.12×106,插入片段均在500bp以上;大于100bp的有效ESTs序列1113条,平均长度725bp,拼接后获得一致性序列420条,其中包括126个叠联群和294个单拷贝EST,BLASTX比对后获得注释序列271条,进一步筛选获得青蛤免疫相关因子基因序列45条,为克隆其免疫防御相关因子的基因提供了重要的基础. 相似文献
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mRNA was isolated from the hepatopancrease of shrimp Penaeus monodon with a PolyAT-tract System 1000 Kit. By using mRNA as template, double - strand cDNA with EcoR I/Xho I ends was synthesized by using a ZAP Express cDNA Synthesis Kit. The cDNA was inserted into the lambda ZAP Express vector predigested with EcoR I/Xho I, and the recombinant DNA was in vitro packaged into lambda phage with GigapackIII Gold packaging extracts. These recombinant phages were then used to transfect E. coli XL1 - Blue MRF', and finally a cDNA expression library was constructed. The library is 7.2 × 10~5 pfu in capacity and its recombination ratio is higher than 99 % . The size of the inserted cDNAs was determined by EcoR I/Xho I digestion of 9 phagemids prepared by in vivo excision of plaques selected randomly from amplified cDNA library . The longest inserted cDNA is about 1.6 kb in length. The complete sequence (about 1.2 kb) of actin cDNA was amplified from the library by PCR reveals that this library contains full-length 相似文献
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XUAN Jinsong FENG Yanbin WENG Manli ZHAO Ge SHI Jinfeng YAO Jianting WANG Xiuliang GUO Baotai QIAO Lixian DUAN Delin WANG Bin 《海洋学报(英文版)》2012,31(6):139-148
A high quality cDNA library was constructed from the brown alga Laminaria japonica,with the titer of 1.2×10 5 pfu/ml.The average insert size of the cDNA library is about 1.6 kb.From the cDNA library,591 cDNA clones were randomly selected and sequenced.As a result,574 EST(expressed sequence tag) sequences were generated.All of the 574 ESTs were submitted to the dbEST database section of GenBank with the accession numbers from CX942625 to CX943198.The cDNA library was screened with a α-32 p labeled 453 bp T P S gene probe,which is a partial sequence yielded from Porphyra yezoensis.Four positive cDNA clones were screened and the sequencing data showed that these four cDNA clones covered majority of L.japonica TPS cDNA sequence.After PCR amplification,sequencing and assembling,the entire ORF(open reading frame) sequence of the T P S gene was obtained,which was named LjTPS.LjTPS encodes a protein containing 908 amino acids with a calculated molecular mass of 101 674 Daltons.The LjTPS gene was successfully expressed in E.coli and rice.The LjTPS gene has potential application both in plant breeding to stress tolerance and in deciphering the T P S gene function and mechanism to stress tolerance. 相似文献
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为了研制氯霉素单克隆抗体,建立氯霉素的简便有效的检测方法.采用碳二亚胺(EDC)方法制备氯霉素免疫抗原和包被抗原,经SDS-PAGE凝胶电泳,三硝基苯磺酸(TNBS)法鉴定表明偶联成功.采用制备的抗原CAP-HS-BSA((CAP-HS,氯霉素琥珀酸酯;BSA,牛血清白蛋白)免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术获得了2株抗氯霉素的杂交瘤细胞株,细胞株体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定.经体内诱生法产生腹水,ELISA检测纯化腹水的效价为1:10~6.抗体的亲和常数分别为:1.13×10~(10) L/mol,1.41×10~(10) L/mol.ELISA检测显示这2株单克隆抗体与氯霉素琥珀酸交叉反应率为300%,与其他抗生素及结构类似物的交叉反应小,表明该单抗可满足建立免疫学检测方法的需要和开发应用的要求. 相似文献
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条斑紫菜丝状孢子体cDNA文库构建及抗病相关基因鉴定 总被引：1，自引：3，他引：1
经过微量总 RNA抽提、c DNA合成、c DNA扩增和克隆等步骤 ,构建了微量条斑紫菜丝状孢子体 c DNA文库 ,并进行了小规模表达序列标签分析。从 1 70条标签序列中鉴定出 6条抗病相关基因序列。这些序列可用于研制抗病单核苷酸多态性标记 ,辅助紫菜抗性遗传改良。 相似文献
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利用SYBR荧光定量PCR技术，制备用于花鲈（Lateolabrax japonicus）PPARα基因实时荧光定量PCR检测的质粒标准品．通过PCR扩增出目的片断344-bp，纯化后连接至pMDI8-T载体，转化宿主菌E．coli DH5α．通过PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析后抽提重组质粒，测定其拷贝浓度，10倍梯度稀释成标准品模板10^8～10^4 copy／mm^3，进行荧光定量PCR分析．结果显示，循环阈值（Ct）与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系． 相似文献