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1.
采用PCR、核酸探针斑点杂交、组织切片等方法研究了PCR检测白斑综合征病毒(WSSV)中的假阴性问题。设计了一对引物用于PCR检测WSSV,PCR扩增的产物长度为235bp,检出极限为0.1pg WSSV DNA。结果表明,PCR检测15例攻毒螯虾鳃样品时出现一例阴性,而经10—106倍稀释后的样品却呈现阳性,推断PCR出现了假阴性。核酸探针斑点杂交及组织切片结果表明注射WSSV的螯虾鳃组织确已被严重感染,进一步证实了PCR假阴性。根据PCR的检出极限及模板稀释梯度,推算出该PCR能成功扩增的引物与模板浓度的比例范围约为2.4×105—2.4×1010。 相似文献
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套式PCR检测斑节对虾白斑症病毒(WSSV) 总被引：1，自引：0，他引：1
解剖患白斑症斑节对虾的鳃组织 ,制备成不同稀释倍数的模板 ,对其进行白斑症病毒 (WSSV)的 PCR扩增 ,结果显示所建立的套式 PCR的灵敏度大约为一步 PCR的 10 4 倍 ;对感染病毒后不同时期的斑节对虾进行 PCR检测 ,发现感染早期经一步 PCR检测为 WSSV阴性的样品 ,套式 PCR的检测结果为阳性 ;对发病虾塘中的几种甲壳类动物进行 PCR检测 ,发现经一步 PCR检测为阴性的长臂虾、秉氏厚蟹和褶痕相手蟹等宿主 ,套式 PCR的检测结果为阳性。表明所建立的 WSSV套式 PCR检测法较普通的一步 PCR有更大的应用价值和意义 相似文献
3.
二温式RT-PCR检测对虾Taura综合征病毒的研究 总被引：15，自引：1，他引：15
设计了一对能扩增大小为231bp对虾Taura综合征病毒(TSV)某段基因的特异性引物，优化建立了能快速检测TSV的二温式RT-PCR。特异性和敏感性试验结果表明。二温式RT-PCR能对3个试验用TSV毒株的RNA进行扩增，并得到与预期大小一致的231bp的扩增产物，而其它3种对虾病原则无相同大小的特异性扩增产物出现；RT-PCR最低能检测到1pg的TSV RNA。应用RT-PCR对320份分别来自广西沿海不同对虾养殖场的对虾样品进行检测，结果共有85份检出TSV。说明TSV在广西沿海地区养殖对虾中已呈现出区域性流行趋势。同时也显示了RT-PCR在TSV临床检测中具有较高的实用性。 相似文献
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利用台湾报道的ＷＳＢＶ的ＰＣＲ引物,成功地扩增出了１４００ｂｐ左右的中国对虾的杆状病毒的ＤＮＡ片段,与预计的产物长度吻合。该引物对经初步离心处理的病虾组织也能扩增出特异性ＤＮＡ条带,而对正常虾组织ＤＮＡ、昆虫杆状病毒（ＡｃＭＮＰＶ）ＤＮＡ进行扩增,均获得阴性结果。说明该引物的特异性较高,对中国对虾的杆状病毒的检测具有一定的实际应用价值。实验结果同时说明ＷＳＢＶ与中国对虾的杆状病毒有同源序列存在,具有一定的保守性;用该引物进行的ＰＣＲ扩增为中国对虾的杆状病毒与其他相关病毒的比较研究提供了一种技术手段。 相似文献
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应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)和环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Ampli-cation,LAMP)两种检测技术分别对2009年广东省粤西地区养殖体系中凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei白斑综合症病毒(White Spot Syndrome,WSSV)、桃拉病毒(Taura Syndrome Virus,TSV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus,IHHNV)的携带情况进行了调查。结果显示,WSSV和TSV的携带率较高,是该地区凡纳滨对虾的主要流行病毒种类;LAMP检测方法与PCR方法具有相当的灵敏度和特异性,但LAMP检测方法更加简单方便、快速且成本低。 相似文献
7.
水产动物致病性副溶血弧菌双重PCR 检测方法的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是多种水产养殖动物的主要病原菌,尤其是可引起凡纳滨对虾幼虾呈毁灭性死亡。本研究基于gyrB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种副溶血弧菌快速、准确的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为285 bp和368 bp。结果表明在同一PCR反应体系中副溶血弧菌可同时扩增大小分别为285 bp和368 bp的2种基因片段,两种引物对4种其他水产动物病原菌无交叉反应;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测8.867 2×103 CFU/mL菌体浓度的副溶血弧菌,对副溶血弧菌模板DNA的检出极限为0.029 3 mg/L;对发病中国对虾糠虾幼体、水产品及虾池养殖用水进行双重PCR检测,呈阳性反应的样品可分离出优势生长的副溶血弧菌。该实验所建立的基于gyrB和toxR两种基因的双重PCR检测方法可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及分子流行病学的调查研究。 相似文献
8.
本文根据GenBank中对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)基因组上的保守序列,采用Taqman-MGB荧光定量PCR方法,设计了一组特异性引物和探针.利用阳性标准模板进行了定量PCR条件的优化研究.结果显示,在101～108拷贝范围内标准曲线的线性关系为R=0.999 4,检测灵敏度达到10拷贝,重复检测的变异系数均小于2％.利用上述建立的方法和条件,测定39份不同来源的对虾样品中IHHNV,检出率为49％.因此所建立的荧光定量PCR具有较高的灵敏度、特异性和重复性,可作为IHHNV快速的定量检测方法. 相似文献
9.
对虾白斑综合症病毒（WSSV）是对虾养殖的主要病害之一,在虾养殖业中造成了严重的损失．本研究从WSSV基因组中克隆到vp41a基因,大小约为900bp,发现该基因编码蛋白VP41A．通过构建重组质粒pET．His一卅J0表达了重组蛋白VP41A,大小约为43kDa．并通过Ni一琼脂糖珠交联下拉实验,在虾血细胞中找到一个能与VP41A相互作用蛋白,质谱分析发现该蛋白为细胞粘连蛋白,说明在WSSV感染宿主细胞的过程中蛋白VP41A可能发挥重要作用．本研究结果推动了WSSV与宿主对虾相互作用的研究,有利于探索病毒复制或转录的关键蛋白,为最终的病毒防治及快诛诊断提供科学依据． 相似文献
10.
对中国对虾卵巢和受精卵细胞进行了电子显微镜超微结构观察，发现卵巢内有球状病毒粒子，大小为80nm左右。受精卵细胞内有传染性皮下和造血组织坏死病毒（IHHNV）感染，其严重影响对虾受精卵的发育，从获得的结果来看，中国对虾病毒（IHHNV）垂直传播的可能性极大。 相似文献
11.
3种水产病原菌简型基因芯片检测技术的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据水产养殖中常见的3种病原菌鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)及迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的研究资料,筛选3个毒力相关基因toxR、aerA、evpA设计引物和探针,构建简型基因芯片,并使用对虾白斑病综合征病毒(WSSV)variable region的PCR荧光标记产物作为表面化学质控。通过已构建和优化的多重PCR反应条件,获得了3个目的基因的PCR产物;经过芯片制作过程的优化,将探针以终浓度20μmol/L溶于50%DMSO,在室温、相对湿度45%的条件下点印于醛基基片表面。扩增的PCR产物与杂交液混合后,在42℃杂交2 h就可检测到理想的杂交信号。芯片的灵敏度试验结果表明,可以检测到的3种水产病原菌的最低模板DNA为:鳗弧菌3×102拷贝、嗜水气单胞菌5×103拷贝、迟缓爱德华氏菌6×101拷贝。该芯片可成功应用于患病大菱鲆内脏的细菌分离物的鉴定。 相似文献
12.
对虾一种无包涵体杆状病毒病原的PCR检测 总被引：4，自引：0，他引：4
为建立对虾无包涵体杆状病毒的快速诊断技术,应用PCR技术分别对暴发性流行病发生前、流行中和发病后的对虾样品进行了检测.根据已克隆的对虾杆状病毒部分基因组序列而设计的引物能特异性地扩增出靶DNA片段,最低可以检测1pg的病素DNA.由典型发病症状对虾的胃、腮、肝胰腺、中肠、游泳足、肌内和心脏等器官和组织中成功地检测到病毒.不同组织和器官经扩增得到的信号强弱不同:病虾的胃扩增得到的信号最强,中肠、肌肉、心脏和游泳足次之,腮和肝胰腺信号最弱,说明病毒在不同组织和器官中数量及感染程度不同.在对虾发病前及发病后,用二次PCR还能检测表面不发病呈隐性感染状态的对虾携带的病毒;而对野生健康虾的检测结果为阴性.研究表明,PCR是检测对虾暴发性流行病快速、灵敏而准确的方法,对病毒病的早期诊断、防治和高健康对虾品种的选育具有指导意义. 相似文献
13.
对虾WSSV人工感染螯虾及其检测 总被引：13，自引：0，他引：13
用对虾白斑综合症病毒（WSSV）人工感染淡水克氏原螯虾（Procambarus clarkii),感染组螯虾3-6d内全部死亡,核酸探针点杂交两次检测感染螯虾的鳃、胃、血淋巴,阳性检出率分别为92%（92%）,89%（86%）,81%（75%）,对照为11%（3%）,3%（5%）,0（0）;光镜下可观察到感染螯虾的胃、鳃组织的靶细胞核肿大,嗜酸性着染,电镜下病变组织细胞核可见形态大小与WSSV一致的病毒粒子;病毒核酸原位杂交两次检测感染螯虾的胃、鳃、阳性检出率均为100%,对照阳性检出率均为0。结果表明：对虾WSSV可感染淡水克氏原螯虾,病毒核酸原位杂交是一种敏感特异的病毒检测方法。 相似文献
14.
INTRODUCTIONThedevelopmentofshrimpcultureshasbeenaffectedseverelybyviraldiseases(CatandSu,1993).Atpresent,however,thepathwayofvirustransmissiontopenaeidshrimpisnotunderstoodanditisthereforedifficulttopreventtheoccurrenceandspreadofshrimpviraldiseases.Toreducethelossescausedbyviralinfection,thedevelopmentofearlyandaccuratediagnostictechniquesisessential(Bruceetal.,1994;Changetal.,1993;Huangetal.,1995;Vickersetal.,1993).Anenzymeimmunoassaytechniquefordetectingbaculoviralmidgutglandnecrosi… 相似文献
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用逆转录聚合酶链式反应检测草鱼出血病病毒的研究 总被引：4，自引：1，他引：4
于1994年5月-1995年7月，根据已克隆的草鱼出血病病毒GCHV-861株cDNA的部分序列，设计合成了两对PCR引物，采用RT-PCR技术对GCHV-861及GCHV-873两病毒株的dsRNA进行扩增。结果表明，两对引物仅能特异地检测出GCHV-861病毒株核酸的存在，而不能对GCHV-873病毒株的核酸进行特异扩增，该方法最小可检测出0.1Pg纯化的GCHV-861病毒dsRNA;采用该方法对GCHV-861人工感染的草鱼和稀有鲫组织进行RT-PCR检测，不仅能检测到发病期显症病鱼中GCHV-861病毒的存在，还能检测发病前期及愈后无出血病症状的病毒携带者中病毒的存在;利用该方法还从本所关桥实验场出血病流行季节收集的发病草鱼体内检测出GCHV的存在，说明所设计的引物具有一定的实际意义;利用该法还能检测出感染病毒的组织培养细胞系GCK和CIK上清液中GCHV的存在。还建立了简易的模板制备方法，采用该方法整个检测过程只需3-4h，可大大缩短检测时间。由此可见，RT-PCR技术是检测GCHV的快速、灵敏而特异的方法，发展和完善该技术对草鱼出血病的早期诊断和防治、抗病育种具有重要意义。 相似文献
16.
参照鱼类病毒性出血性败血症病毒序列,根据PCR引物设计的原则,设计巢式PCR引物,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对如何快速检测鱼类病毒性出血性败血症病的方法进行了较为系统的研究,并对RT-PCR的反应条件进行了优化.结果表明,巢式RT-PCR扩增获得279bp的特异性片断,阴性对照无扩增条带.巢式RT-PCR扩增出的特异性片段经测序分析,结果证实与报道的序列完全一致.该方法最低可检测出0.1pg的鱼类病毒性出血性败血症病毒RNA.初步建立了VHSV的巢式RT-PCR检测方法,该方法灵敏、特异,可为VHSV的检测提供一个快速、有效的手段. 相似文献