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用逆转录聚合酶链反应检测草鱼出血病病毒的研究 总被引：3，自引：1，他引：3
于１９９４年５月－１９９５年７月，根据已克隆的草鱼出现血病病毒ＧＣＨＶ－８６１株ｃＤＮＡ的部分序列，设计合成了两对ＰＣＲ引物，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术对ＧＣＨＶ－８６１ＧＣＨＶ－８７３两病毒株的ｄｓＲＮＡ进行扩增，结果表明，两对引物仅能特异地检测了ＧＣＨＶ－８６１病毒株核素的存在，而不能对ＧＣＨＶ－８７３病毒株的核酸进行特异扩增，该方法是最小可检测出０．１ｐｇ纯化的ＧＣＨＶ－８６１病毒ｄｓＲＮＡ，采用 相似文献
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应用ＲＴ－ＰＣＲ技术检测草鱼出血病病毒。建立了一种快速、简易而可靠的ｄｓＲＮＡ模板的制备方法。应用该方法制备模板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，可以有效地检测出病鱼组织及病毒感染的培养细胞裂解液中的草鱼出血病病毒，且全过程只需３～４ｈ，大大缩短了检测时间 相似文献
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参照鱼类病毒性出血性败血症病毒序列,根据PCR引物设计的原则,设计巢式PCR引物,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对如何快速检测鱼类病毒性出血性败血症病的方法进行了较为系统的研究,并对RT-PCR的反应条件进行了优化.结果表明,巢式RT-PCR扩增获得279bp的特异性片断,阴性对照无扩增条带.巢式RT-PCR扩增出的特异性片段经测序分析,结果证实与报道的序列完全一致.该方法最低可检测出0.1pg的鱼类病毒性出血性败血症病毒RNA.初步建立了VHSV的巢式RT-PCR检测方法,该方法灵敏、特异,可为VHSV的检测提供一个快速、有效的手段. 相似文献
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创伤弧菌是一种可感染人类的河口病原菌。建立快速，特异而敏感的检测方法，有助于创伤弧菌感染的早期疾病诊断和及时治疗。本研究设计了针对vvhA基因的一系列引物（包括两对外部引物和两对内部引物），采用环介导等温扩增技术（LAMP）来检测创伤弧菌。结果显示，本方法的最适扩增温度是63℃，反应仅需35分钟。扩增产物不仅可以用含有DNA ladder的琼脂糖凝胶电泳检出，也可借助钙黄绿素直接肉眼观察。采用45株菌株检测该方法的特异性，其中所有创伤弧菌均被检出而其他菌株检测结果皆为阴性。本方法的敏感性是普通PCR扩增的100倍，同时利用该方法可以准确检测出所有的模拟样品、临床标本及环境样品。与其他已知方法比较，针对vvhA基因的介导等温扩增技术可以快速、简单、敏感及特异地鉴定创伤弧菌。 相似文献
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根据斜带石斑鱼（Epinephelus coioids）神经坏死病毒（orang-spotted nervous necrosis virus，0GNNV）的主衣壳蛋白（major capsid protein，MCP）基因的保守序列，设计一对引物，从感染0GNNV的斜带石斑鱼组织匀浆液提取RNA为模板进行RT-PCR扩增，得到426bp的cDNA片断。用得到的RT-PCR产物加上地高辛（DIG）标记作为核酸探针。通过注射病毒提取液人工感染一组斜带石斑鱼，解剖感染病毒的斜带石斑鱼，从中分离出脑和眼睛，运用原位杂交技术检测组织中的OGNNV。实验表明，原位杂交具有较高的灵敏性和特异性，可以用原位杂交的办法来检测养殖的石斑鱼是否有携带该病毒，达到监控和预防神经坏死病爆发的目的。本实验还采用了H＆E染色方法检测了感染NNV的石斑鱼脑部和眼部组织，观察细胞内的坏死部分。与原位杂交做对比，提高了检测的可靠性和准确性。本实验建立的石斑鱼神经坏死病毒的ISH检测方法有着较高的特异性和敏感性，易于操作，有助于石斑鱼神经坏死病毒的组织定位、发病机理的研究。 相似文献
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淋巴囊肿病毒实时定量PCR检测方法的建立和应用 总被引：2，自引：0，他引：2
选取淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus,LCDV)主衣壳蛋白(MCP)基因保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物,通过优化反应条件,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR的检测方法,并进行了敏感性、特异性分析.SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应体系的最佳引物浓度为0.5 μmol/L,方法的检测限为30个病毒拷贝,扩增产物的Tm值为74.5 ℃.该方法对淋巴囊肿病毒有特异性,不能扩增流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、虎纹蛙病毒(TFV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)及真鲷虹彩病毒(RSIV).对12份发病牙鲆鱼样品进行检测,均感染淋巴囊肿病毒;20份无临床症状的牙鲆经检测不含淋巴囊肿病毒.建立的LCDV的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法,具有成本低、特异、灵敏、快速等优点,可用于淋巴囊肿病毒的早期诊断. 相似文献
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利用台湾报道的ＷＳＢＶ的ＰＣＲ引物,成功地扩增出了１４００ｂｐ左右的中国对虾的杆状病毒的ＤＮＡ片段,与预计的产物长度吻合。该引物对经初步离心处理的病虾组织也能扩增出特异性ＤＮＡ条带,而对正常虾组织ＤＮＡ、昆虫杆状病毒（ＡｃＭＮＰＶ）ＤＮＡ进行扩增,均获得阴性结果。说明该引物的特异性较高,对中国对虾的杆状病毒的检测具有一定的实际应用价值。实验结果同时说明ＷＳＢＶ与中国对虾的杆状病毒有同源序列存在,具有一定的保守性;用该引物进行的ＰＣＲ扩增为中国对虾的杆状病毒与其他相关病毒的比较研究提供了一种技术手段。 相似文献
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对虾一种无包涵体杆状病毒病原的PCR检测 总被引：4，自引：0，他引：4
为建立对虾无包涵体杆状病毒的快速诊断技术,应用PCR技术分别对暴发性流行病发生前、流行中和发病后的对虾样品进行了检测.根据已克隆的对虾杆状病毒部分基因组序列而设计的引物能特异性地扩增出靶DNA片段,最低可以检测1pg的病素DNA.由典型发病症状对虾的胃、腮、肝胰腺、中肠、游泳足、肌内和心脏等器官和组织中成功地检测到病毒.不同组织和器官经扩增得到的信号强弱不同:病虾的胃扩增得到的信号最强,中肠、肌肉、心脏和游泳足次之,腮和肝胰腺信号最弱,说明病毒在不同组织和器官中数量及感染程度不同.在对虾发病前及发病后,用二次PCR还能检测表面不发病呈隐性感染状态的对虾携带的病毒;而对野生健康虾的检测结果为阴性.研究表明,PCR是检测对虾暴发性流行病快速、灵敏而准确的方法,对病毒病的早期诊断、防治和高健康对虾品种的选育具有指导意义. 相似文献
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音响驯化技术被广泛应用于海洋牧场及淡水水域对鱼类行为的控制,但在采用何种频率和波形声音方面的研究积累尚少。试验室条件下,利用400 Hz矩形波连续音对鲤、草鱼进行了音响驯化试验。结果表明,鲤、草鱼的反应时间和聚集时间均逐日减少。平均反应时间分别为25.4 s和34.6 s,平均聚集时间分别为48.9 s和56.9 s;聚集率则逐日增加.驯化5 d后,鲤、草鱼的聚集率均达到100%,平均聚集率分别为89.7%和94.1%。由此可见.400 Hz矩形波连续音对鲤、草鱼均有明显的驯化作用。 相似文献
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PHA体外诱导草鱼白细胞产生γ-干扰素的研究 总被引：10，自引：2，他引：10
于1997年10月－1999年3月，采用半数细胞病变抑制等方法，进行植物凝集素（Phytoagglutinin,PHA)体外诱导草鱼白细胞产生γ－干扰素的研究，结果表明，在PHA诱导的草鱼白细胞培养液中出现了一种抗病毒因子，经理化和生物学性质鉴定证明，该因子是一种干扰素活性物质。但它不同于病毒诱导的α／β－干扰素，主要表现为：对56℃、pH＝2和0．1％SDS敏感；其活性不能被病毒诱导的干扰素抗体所中和；其诱生剂为PHA，来源于白细胞；在诱导条件下，佛波酯（PMA）和白细胞介素－2（IL－2）能显著地促进其诱生，这些特性与人类和高等脊椎动物中报道的γ－干扰素相符，表明是一种γ性质的干扰素。 相似文献
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对2015—2016年天津地区鲤鱼养殖场采集的发生鲤浮肿病毒(CEV)/锦鲤睡眠病(KSD)的鲤鱼样品,进行套式PCR检测和人工浸泡感染试验,并测定养成期鲤鱼感染率。实验观察研究发现,所采集样品均表现为体色发黑,头部上方颅骨软组织周围皱缩,眼球凹陷,鳃粘脏,黏液较多,常滞游于浅水区水面。套式PCR检测结果显示全部10个样品均出现特异性目的条带,为CEV阳性。目的产物测序后经NCBI BLAST,与已报道的CEV相关序列相似性介于85%—99%;系统发育树分析显示样品编号JY1856与JY1650位于同一分支,与已知CEV病毒株亲缘关系较近,而其余8个样品位于同一分支,与已知CEV病毒株亲缘关系较远。通过人工浸泡感染健康鲤鱼,半数致死时间为55d,累计死亡率为71.1%±3.2%,并从试验感染鱼组织中检测到CEV病毒DNA。养成期鲤鱼CEV携带率为77.5%。以上结果表明,天津地区养殖鲤鱼中存在CEV感染,揭示了我国鲤鱼养殖产业可能面临新的疫情,需引起养殖业的高度重视。 相似文献
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Diagnosis of iridovirus in large yellow croaker by PCR 总被引：1，自引：0，他引：1
A rapid and sensitive PCR-based method for the detection of the large yellow croaker iridovirus(LYCIV) is described,which involves the amplification of a 295 bp fragment of the LYCIV ATPase gene from DNA isolated from naturally infected fish spleen.Sequencing of LYCIV ATPase gene fragment showed it shared 100% nucleotide sequence homology with the corresponding region of the ATPase gene of red sea bream iridovirus(RSIV) and sea bass iridovirus(SBIV),suggesting that LYCIV was homologous with RSIV and SBIV at least in part of the gemone.The specificity and sensitivity of the PCR procedure were tested on the iridovirus-infected fishes,the expected fragment was detected from spleen DNA samples of infected fishes,whereas no fragments were amplified from healthy fish spleen DNA,white spot syndrome baculoviruses(WSBV) DNA and pseudorabies virus(PRV) DNA.Detection limit of this method was 10-7 ng positive plasmid DNA containing target sequence,equal to about 100 virions.In the infected experiment,first positive detection(1/4) appeared at Day 3 post-infection,all fish(4/4) tested positive at Day 7,however obvious symptoms were observed at Day 8,so LYCIV infection could be detected prior to the appearance of obvious symptoms.These results indicate that this PCR method could be used for early,rapid and specific detection of LYCIV infection. 相似文献
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草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒(GCRV)引起的草鱼养殖业一种严重的病毒性出血病,给草鱼养殖产业造成重大损失。该病毒是一种双链分节段RNA病毒,根据GCRV多个病毒分离株基因序列分析及临床发病特点,共有三种基因型GCRV,其中基因Ⅰ型和Ⅱ型较为流行。通过细胞分离培养基因Ⅰ型(GCRV-ZV8909)和Ⅱ型(GCRV-HZ13) GCRV,研制出草鱼出血病二价细胞灭活疫苗,通过绝对定量的方法,测定基因Ⅰ型和Ⅱ型的病毒含量分别为2.0×109及1.5×106 copies/mL。用生理盐水将其分别进行50倍稀释和100倍稀释,包括原液及生理盐水对照共4组,分别腹腔注射免疫(20±5)g健康草鱼,剂量均为0.2mL/尾,每组40尾,各组于免疫后3、5、7、14、21、28、42、56、70、84 d分别取3尾采集血液制备血清。分别利用经原核表达并纯化制备两种基因型GCRV的VP7蛋白以及实验室保存的草鱼IgM单抗,建立了三抗体夹心酶联免疫方法(TAS-ELISA)分析评价疫苗体液免疫效果。结果表明,草鱼经腹腔注射不同剂量的细胞灭活疫苗后,与对照组相比,各免疫组血清抗体均有不同程度的提高,且原液组与50倍稀释组基本持平,但都高于100倍稀释组,各免疫组在免疫后5d即可检测到两种基因型GCRV抗体,且抗体水平持续到84d,但两种基因型抗体水平达到高峰的时间不一致,抗基因Ⅰ型GCRV抗体达到高峰是在28d,抗基因Ⅱ型GCRV抗体是在14d达到高峰。两种基因型抗体水平达到高峰时的血清效价分别为1︰800、1︰600。免疫保护率实验结果表明,原液组保护率最高,为67%,50倍稀释组为60%,100倍稀释组只有33%。 相似文献
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为了进一步评估由白芍(Radix paeoniae Alba)、杜仲(Eucommia ulmoides)和知母(Rhizoma anemarrhenae)组成且具有免疫增强作用的复方制剂A、B、C对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)组织形态和生长性能方面可能存在的风险,本试验将二龄草鱼随机分成12个试验组和2个对照组,分别连续投喂含有不同复方制剂的饲料和空白饲料,在试验第7、14、21、28天分别随机从对应试验组中采集5尾草鱼肝胰脏、脾脏、肾脏和肠道进行切片制作和组织形态分析;在试验第0、29天分别随机从对应试验组中采集10尾草鱼进行肥满度、增重率、特定生长率、脏体比和肠道承重力测定。结果表明,分别以2%、4%剂量添加于草鱼饲料中的复方制剂A、B、C对试验草鱼阶段增重率、特定生长率、饵料系数、肝胰体比、肾体比和肠道承重力系列指标均无异常影响。组织形态分析方面,复方制剂A对草鱼肝胰脏、脾脏、肾脏和肠道具有良好的安全性,而复方制剂B、C经连续投喂21天起,对应剂量组草鱼肝胰脏、肾脏逐渐呈现不同程度的组织病变。本文得出结论认为,即使完全符合允饲要求的天然植物品种,缺乏基于较全面的评价维度试验证明其具有使用安全性,则容易仅关注允饲天然植物在效果表达的表象,而忽略其诱发的组织病变造成组织器官的功能衰退。 相似文献
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本实验研究了高温(28℃,33℃,35℃,37℃)胁迫下草鱼(Ctenopharyngodon idellus)体内热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)的表达模式以分析高温影响草鱼存活的生理机制。在不同温度下,实时记录草鱼存活状态和呼吸频率,并利用蛋白杂交方法测定热休克蛋白(Hsp70,Hsp73)表达量的变化。结果表明,当水温超过28℃,草鱼存活率随温度升高而降低,在35℃和37℃时全部死亡;呼吸频率随温度升高而升高,各温度间差异显著(P<0.05);温度升高会诱导草鱼肝脏和肌肉中Hsp73表达量升高,表明热休克蛋白的上调表达是草鱼抵御温度应激的重要生理响应机制。 相似文献
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采用陆基围隔实验法,对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲢鱼(Hypophythalmichthys molitrix)和鲤鱼(Cyprinus carpio)不同混养系统的能量收支和转化效率进行了研究。实验共设置7个处理组,分别为草鱼单养(G)、草鱼和鲢鱼二元混养(GS)、草鱼和鲤鱼二元混养(GC)以及草鱼、鲢鱼和鲤鱼按照不同比例放养的三元混养(GSC1、GSC2、GSC3和GSC4)。研究结果表明,实验期间各系统接收的总太阳辐射能为4 970MJ.m-2;光能利用率在0.25%～0.33%之间,各处理组之间差异显著(P<0.05);光合能转化效率以草鱼单养组最低,且与GS、GSC2、GSC3和GSC4处理组之间差异显著(P<0.05);各混养组与草鱼单养组相比,总能量转化效率分别提高了43.51%、11.62%、30.16%、64.30%、38.49%和61.90%,其中,以GSC2为最高,GSC4次之;单位净产量耗饲料能以单养草鱼组最高,显著高于GS、GSC2和GSC4处理组(P<0.05);各处理组沉积能量在3.42～17.73MJ.m-2之间,各处理组间差异显著(P<0.05),各组沉积能量占总投入能量的比例分别为30.92%、12.18%、39.08%、29.43%、28.90%、28.87%和29.80%。本研究结果表明,不同食性鱼类混养系统能够提高光合能转化效率和总能量利用率,降低沉积能量,从而有效提高系统对输入能量的利用效率。 相似文献