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采用冻融破壁和蛋白质分步提取等技术,对钝顶节旋藻2-DE分析蛋白制备方法作了改进,并试用于螺旋手性差异表达蛋白研究,结果表明:(1)钝顶节旋藻细胞反复冻融5次完全破碎,用Tris-HC1提取液提取3次可提得近87％的水溶性蛋白,再用SDS(十二烷基磺酸钠)提取液可从沉淀中提得水不溶性蛋白;(2)将上述水溶性和水不溶性蛋白分别用TCA/丙酮法纯化后作双向电泳(2-DE)分析,可辨蛋白点分别达500和760多个,而两者间的匹配率仅7％,说明分离度好且质量高;(3)利用此法获得了13个与钝顶节旋藻螺旋手性相关的候选蛋白,其中5个为首次发现,候选蛋白功能涉及光合作用、能量代谢、物质外排和环境适应等;(4)本文所建的“冻融破壁分步提纯法”与现有节旋藻2-DE蛋白制备方法相比,具有操作简便、仪器设备简单、成本低廉及信息量更丰富等优点. 相似文献
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从节旋藻属5个品系和螺旋藻属1个品系中克隆了hoxY基因的部分序列.序列长度都是479bp.在节旋藻中该基因GC含量为46.0%～46.6%,螺旋藻中为43.5%.节旋藻各品系间序列的相似性介于93.7%～100%,明显高于节旋藻属和螺旋藻属间的序列相似性（69.5%～72.2%）.2个属中镍铁氢化酶小亚基HoxY氨基酸序列的比较也表明螺旋藻和节旋藻之间存在较大差异.利用MEGA2通过比较核酸序列构建了系统树,表明螺旋藻和节旋藻属处于不同的分枝. 相似文献
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为探索节旋藻藻蓝蛋白的生物合成机理,以钝顶节旋藻(Arthrospira platensisFACHB314)基因组DNA为模板克隆了藻蓝蛋白α亚基基因cpcA、催化脱辅基蛋白与色基结合的裂合酶基因cpcE和cpcF,以及催化色基合成的铁氧蛋白氧化还原酶基因pcyA;以Synechocystissp.PCC6803基因组DNA为模板克隆了亚铁血红素氧化酶基因hox1。然后分别将cpcA、cpcE和cpcF基因构建到质粒pACYCDuet-1中,将hox1和pcyA基因构建到质粒pET-24a(+)中,用电击法将二者共同转化E.coliBL21(DE3),经诱导表达得到具有荧光活性的节旋藻藻蓝蛋白α亚基。在590 nm激发波长下,荧光发射峰为637.8 nm,证实了节旋藻自身的裂合酶CpcE和CpcF能够催化色基PCB与藻蓝蛋白脱辅基结合产生有荧光活性的藻蓝蛋白α亚基,为表达有荧光活性的藻蓝蛋白提供理论和实验基础。 相似文献
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为构建O1型霍乱弧菌Fosmid文库并对文库进行分析,采用低熔点琼脂糖包埋法提取O1群霍乱弧菌N16961完整基因组,用随机剪切法将基因组进行片段化处理,脉冲电泳分离片段化DNA并切胶回收33～48kb之间的DNA片段,然后对DNA片段进行末端平滑化和磷酸化处理,与pCC1FOS载体连接,经包装、转染后构建霍乱弧菌Fosmid文库。平均插入片段为37kb,共保存9 600个克隆,空载率小于2%。本文库符合文库的构建要求,文库的建立为O1霍乱弧菌重要基因及其功能的研究奠定了基础。 相似文献
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用氯化锂法从眼点拟微球藻(Nannochloropisis oculata)中提取DNA并对其提取条件进行了优化。新鲜藻细胞在提取液(0．6mol／L LiCl，0．8％Sakosyl，20mmol／L EDTA(pH8．0)，0．4％PVP，10mmol／L Tris-HCl(pH8．0)，5％β—巯基乙醇)中经过55℃温育30min，每mg鲜藻可提取20—40mg DNA，提取的DNA分子量在23kb左右，可用于PCR、限制性酶切等。 相似文献
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为探究蓝藻藻胆体核心色素蛋白-别藻蓝蛋白单个亚基的光学活性和功能,本研究克隆了钝顶节旋藻(Arthrospira platensis FACHB314)中的脱辅基别藻蓝蛋白基因apcAB及其亚基基因apcA和apcB。节旋藻基因组中apcAB全长共1 056 bp,由apcA和apcB串联组成,中间间隔84 bp。其中,apcA和apcB基因的全长均为486 bp,且均编码161个氨基酸,预测分子量分别约为17.39和17.33 kDa,它们分别编码的α和β亚基均属于Globin＿like超级家族,系统进化树分析显示其氨基酸序列在蓝藻和节旋藻中较为保守。将克隆出的亚基基因apcA、apcB分别同前期A.platensis FACHB314中获得的藻蓝胆素合成相关基因ho和pcyA以及色基裂合酶基因(cpcE、cpcF、cpcU、cpcS、cpcT)共同转化至大肠杆菌中,获得重组别藻蓝蛋白亚基菌株E.coli HPEFUSTA、E.coli HPEFUSTB。SDS-PAGE和Western Blot均显示重组菌株中已成功表达别藻蓝蛋白单亚基。荧光检测结果显示,在600 nm波长激发下,... 相似文献
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《中国海洋大学学报(自然科学版)》2017,(11)
紫菜腐霉(Pythiumporphyrae)是一种专性侵染紫菜并引起紫菜赤腐病的病原菌。为了深入了解紫菜腐霉的遗传信息,本文计划对其开展全基因组测序,而制备高质量的DNA样品是关键性工作。海洋生物生境和代谢的特殊性,细胞中富含的一些次级代谢物质往往影响着DNA样品的质量。紫菜腐霉的基因组DNA样品中具有严重的RNA污染,即使通过延长RNase A降解时间和增加降解次数也不能完全消除其中的RNA,无法获得满足于PacBio文库构建和测序的DNA样品。本研究首先通过琼脂糖凝胶电泳(Agarosegel electrophoresis,AGE)来区分DNA和RNA,然后将DNA条带所在的胶块切下并放入透析袋中继续电泳,使DNA从胶条中迁移到透析袋内的缓冲液中,从而获得DNA的TAE溶液。然后通过透析的方法去除DNA的TAE溶液中的乙酸钠,最终获得DNA的TE溶液。经AGE检测发现DNA条带清晰、无RNA污染;经脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)检测发现DNA完整性较好,可用于PacBio文库的构建和测序。 相似文献
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大黄鱼(Pseudosciaena crocea)热激蛋白的基因克隆、原核表达及抗血清的制备 总被引：1，自引：1，他引：1
应用trizol裂解法提取象山港网箱养殖大黄鱼肝脏总RNA,采用RTPCR获得大黄鱼cDNA;通过设计特异引物进行PCR扩增,将PCR产物转化到质粒并直接测序,得到1.7kb的目的基因;同时将此目的基因连接到表达质粒pSBET中,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达以及表达产物的分析。克隆基因的表达产物经SDSPAGE分析表明,HSP基因的蛋白分子量为60kDa左右,与阅读框的编码大小一致;表达蛋白经纯化后免疫小鼠制备抗血清。Westernblotting检测结果表明,制备的抗血清与HSP蛋白起较强的特异性反应。HSP基因的系统进化分析表明,大黄鱼与非洲爪蟾最为接近,从侧面印证了脊椎动物中两栖纲动物与鱼纲动物的亲源关系。通过大黄鱼HSP基因的提取和分析,可为以后制备出核酸探针、筛选和克隆出一批具有优良性状的基因、构建基因文库等研究工作奠定基础。 相似文献
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分别采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法和高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定了低聚古罗糖醛酸的数均分子量。结果表明:DNS比色法可直接测定低聚古罗糖醛酸的数均分子量,以麦芽糖和古罗糖醛酸标准三糖分别作为标准品,其测定结果相近,该方法准确度高,重复性好;HPGPC法简便易行,可通过测定低聚古罗糖醛酸的重均分子量(Mw)和分子量分布宽度D间接计算数均分子量,该法测定结果与前者结果相比有较大差别,可能与2种方法使用的标准品不同有关。 相似文献
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首次将SRAP(sequence-related amplified polymorphism)方法引入中华白海豚(Sousa chinensis)多态性研究中,利用高分辨率的毛细管凝胶电泳分析了模板DNA、Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶等因素对SRAP-PCR扩增结果的影响.确定了me1-em5为扩增中华白海豚基因组DNA的最佳引物对.并进一步确立了适合中华白海豚的SRAP最佳反应体系:25 mm3体系中,模板DNA浓度为0.8 ng/mm3,Mg2+浓度为1.0 mmol/dm3,dNTP浓度为0.1 mmol/dm3,引物浓度为0.2μmol/dm3,Taq DNA聚合酶浓度为0.04 U/mm3.利用该反应体系对10个白海豚样品进行SRAP分析的结果表明,不同样品间DNA谱带清晰、多态性丰富.证实该体系稳定可靠,可以用于中华白海豚的分子标记研究. 相似文献
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采用化学裂解和酶解相结合的方法，进行了深海沉积物中微量DNA的提取，并采用DNA吸附树脂进行纯化。结果表明，该方法能有效地去除沉积物中的腐殖酸等抑制剂，每克湿重沉积物样品可得到DNA约16μg，回收率可达95％，所得到的DNA分子片段均在23kb左右，纯化后的DNA可直接应用于各种分子生物学操作。利用细菌16SrDNA通用引物对所提取的深海沉积物DNA进行了PCR—RRJ及系统发育分析，各主要细菌类群均能检出，证实该方法可以应用于深海等极端环境中微生物的多样性调查、系统发育分析以及特殊功能基因的筛选，同时还可应用于环境样品中生物量的半定量估计。 相似文献
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胶州湾浮游桡足类18S核糖体RNA基因(18S rDNA)扩增及序列变异初步研究 总被引：3，自引：0，他引：3
采用PCR扩增、文库构建、限制性片段长度多态性分析、序列分析和系统学分析等方法，初步研究了夏季胶州湾上层海水浮游桡足类核糖体小亚基RNA基因(18S rDNA)约1．5kb片段的序列变异。从浮游生物混合DNA中选择性扩增桡足类18S rDNA，建立桡足类18S rDNA变异类型文库，并从文库中随机挑选的30个克隆进行分析。结果表明，Vsp Ⅰ限制性内切酶能将这些克隆分成频率分别为0．17、0．23和0．6的3种操作分类单元(OTUs)，遗传多样性指数达到0．95。3条OTU代表克隆序列与甲壳纲桡足亚纲核苷酸差异数在75．4—97．8之间，而与其他亚纲的差异都高于100。3条OTU代表克隆序列均属于桡足亚纲，其中，AY437861和AY437862属于哲水蚤目。3条OTU代表克隆序列可分为2个高变异区和3个相对保守区，其GC％分别为47．37％、48．16％和48．57％。研究结果表明，混合DNA提取方法简单，设计的引物可选择性地扩增浮游桡足类18S rDNA，根据18S rDNA序列序列变异描述浮游桡足类多样性是可行的。研究结果也为在浮游桡足类分类中引入18S rDNA序列奠定了基础。 相似文献
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深海环境通常具有高盐,高压,高/低温,无光照等特点,使得海洋微生物存在一套独特的生理代谢机制和分子细胞结构,然而迄今绝大部分深海微生物不能在实验室条件下被分离培养,深海微生物资源开发遇到很大挑战。本研究通过不依赖培养的方法研究海洋微生物的基因资源,构建了南海深海沉积物fosmid宏基因组文库,共获得约39 600个克隆,插入片段范围在24~45 kb之间,平均插入片段大小为33 kb,克隆片段的总库容达到1 320 Mb。通过功能筛选获得3个具有淀粉酶活性的克隆子,选取其中最适温度较低的amy7作为进一步研究对象。构建amy7插入片段的重组质粒文库,获得一个同样有淀粉酶活性的克隆子amy7-6。经测序,克隆子amy7-6含有3 291 bp插入片段,序列比对分析后发现其中一个大小为1 920 bp的ORF,其编码的蛋白质序列(AmyS)与各种来源的糖苷酶有着较高的相似性。 相似文献
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The molecular size distribution of humic substances has been investigated in two recent sediment samples of different ages taken from a single core sample collected off Walvis Bay, south-west Africa. Extractable humic acids were found to be by far the major form of organic carbon in both sediments, the near-surface younger sample containing predominantly high molecular weight (>100 000 molecular weight) humic acids and little fulvic acids whilst the deeper, older sample contained relatively less humic acid and relatively more fulvic acid of a range of molecular weights. A significant age difference was found between the >300 000 molecular weight and the <30 000 molecular weight fractions of the near-surface sample, the lower molecular weight fraction being older than the higher molecular weight fraction.The data suggest that in this rapidly accumulating, organic-rich sediment the first step en route from the planktonic matter to the humic complexes is direct and rapid incorporation of the biogenic material into high molecular weight humic acids. 相似文献