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1.
白斑综合症杆状病毒（WSBV）PCR检测方法的改进及应用 总被引：7，自引：0，他引：7
斑节对虾Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎ白斑综合症是由白斑综合症杆状病毒（ＷＳＢＶ）所致。患有典型斑综合症的斑节对虾,用两种提取病毒模板ＤＮＡ的方法,进行ＰＣＲ扩增：一咱是用传统的方法,即蛋白酶Ｋ,ＣＴＡＢ等消化,酚／氯仿抽提,乙醇沉淀得到ＤＮＡ;另一咱是用改进的煮沸法提取病毒ＤＮＡ。对比发现且一种方法稳定性及敏感性比前者高,重复性好。用后一种方法对病虾 的复眼进行检测,ＰＣＲ结果为阳性。应用后一种 相似文献
2.
对虾白斑综合症病毒vp15基因的RNA干扰研究 总被引：1，自引：0，他引：1
VP15是对虾白斑综合症病毒(WSSV)的一种核衣壳蛋白,以往的研究表明VP15属DNA结合蛋白,具有潜在的浓缩包装病毒基因组的功能.利用RNAi技术将vp15基因沉默,来研究vp15基因沉默后对WSSV增殖及结构的影响.体外合成了vp15基因的特异双链RNA(vp15-dsRNA)和非特异双链RNA(gfp-dsRNA),分别与WSSV混合共注射淡水原克氏螯虾.在感染后24、36、48 h,每个实验组分别取病虾步足肌肉,样品用Trizol试剂盒提取RNA用于RT-PCR检测、用病毒检测试剂盒提取DNA模板用于荧光定量PCR分析.另外每组随机选取1只虾,取中肠,用于树脂包埋组织超薄切片分析.逆转录PCR分析结果显示vp15-dsRNA能特异性敲除vp15基因转录表达,实时荧光定量PCR分析结果显示vp15-dsRNA干扰vp15基因的表达能有效抑制WSSV病毒粒子的增值.此外,利用树脂包埋组织超薄切片电子显微镜技术观察发现vp15基因被干扰后病毒粒子数量上明显降低并且引起病毒粒子包装异常.通过vp15基因特异dsRNA干扰,有效抑制了WSSV病毒增殖,此外进一步阐明VP15蛋白的功能及其在病毒组装方面的重要作用,对进一步了解病毒组装以及病毒防治具有重要的意义. 相似文献
3.
对虾一种无包涵体杆状病毒病原的PCR检测 总被引：4，自引：0，他引：4
为建立对虾无包涵体杆状病毒的快速诊断技术,应用PCR技术分别对暴发性流行病发生前、流行中和发病后的对虾样品进行了检测.根据已克隆的对虾杆状病毒部分基因组序列而设计的引物能特异性地扩增出靶DNA片段,最低可以检测1pg的病素DNA.由典型发病症状对虾的胃、腮、肝胰腺、中肠、游泳足、肌内和心脏等器官和组织中成功地检测到病毒.不同组织和器官经扩增得到的信号强弱不同:病虾的胃扩增得到的信号最强,中肠、肌肉、心脏和游泳足次之,腮和肝胰腺信号最弱,说明病毒在不同组织和器官中数量及感染程度不同.在对虾发病前及发病后,用二次PCR还能检测表面不发病呈隐性感染状态的对虾携带的病毒;而对野生健康虾的检测结果为阴性.研究表明,PCR是检测对虾暴发性流行病快速、灵敏而准确的方法,对病毒病的早期诊断、防治和高健康对虾品种的选育具有指导意义. 相似文献
4.
以患病死亡的甲壳上具白斑的斑节对虾(Penaeusmonodon)虾头及从中提取的病毒悬液分别感染中国对虾(Penaeuschinensis)幼虾及日本对虾(Penaeusjaponicus)。感染后此2种对虾均发病死亡 ,且甲壳上均有白斑。电镜下对人工感染的中国对虾幼虾及日本对虾的组织器官进行观察发现了大量的病毒。此病毒为杆状 ,具囊膜 ,无包涵体 ,大小为295nm×105nm。此病毒的形态发生起始于细胞核 ,并可分为4个阶段 :病毒基质的形成、囊膜的形成、病毒的装配和完整的病毒粒子的形成。病毒的装配过程是与其大量迅速繁殖相适应的。 相似文献
5.
对虾WSSV人工感染螯虾及其检测 总被引：13，自引：0，他引：13
用对虾白斑综合症病毒（WSSV）人工感染淡水克氏原螯虾（Procambarus clarkii),感染组螯虾3-6d内全部死亡,核酸探针点杂交两次检测感染螯虾的鳃、胃、血淋巴,阳性检出率分别为92%（92%）,89%（86%）,81%（75%）,对照为11%（3%）,3%（5%）,0（0）;光镜下可观察到感染螯虾的胃、鳃组织的靶细胞核肿大,嗜酸性着染,电镜下病变组织细胞核可见形态大小与WSSV一致的病毒粒子;病毒核酸原位杂交两次检测感染螯虾的胃、鳃、阳性检出率均为100%,对照阳性检出率均为0。结果表明：对虾WSSV可感染淡水克氏原螯虾,病毒核酸原位杂交是一种敏感特异的病毒检测方法。 相似文献
6.
套式PCR检测斑节对虾白斑症病毒(WSSV) 总被引：1，自引：0，他引：1
解剖患白斑症斑节对虾的鳃组织 ,制备成不同稀释倍数的模板 ,对其进行白斑症病毒 (WSSV)的 PCR扩增 ,结果显示所建立的套式 PCR的灵敏度大约为一步 PCR的 10 4 倍 ;对感染病毒后不同时期的斑节对虾进行 PCR检测 ,发现感染早期经一步 PCR检测为 WSSV阴性的样品 ,套式 PCR的检测结果为阳性 ;对发病虾塘中的几种甲壳类动物进行 PCR检测 ,发现经一步 PCR检测为阴性的长臂虾、秉氏厚蟹和褶痕相手蟹等宿主 ,套式 PCR的检测结果为阳性。表明所建立的 WSSV套式 PCR检测法较普通的一步 PCR有更大的应用价值和意义 相似文献
7.
白斑综合症杆状病毒致病性特征 总被引：1，自引：0，他引：1
对白斑综合症杆状病毒（ＷＳＢＶ）致病性特征的研究结果表明：ＷＳＢＶ的致病性与斑节对虾Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ个体大小无关,ＷＳＢＶ的致病力与感染方式和病毒数量有关;在盐度为１４、温度为２８－３２℃的海水中,游离ＷＳＢＶ在４ｈ内失去感染活性;体长７ｃｍ的白斑综合症死亡斑节对虾,其携带的ＷＳＢＶ在５７ｈ失去感染活性;体长７ｃｍ死亡斑节对虾经２８℃空气干燥,其携带的ＷＳＢＶ在５０ｈ失去感染活性;ＷＳＢＶ不能通过体表感染健康斑节对虾,而斑节对虾摄食一定数量病毒才能导致感染;水不能作为游离ＷＳＢＶ的载体传播ＷＳＢＶ。 相似文献
8.
白斑综合症杆状病毒致病性特征 总被引：19，自引：1，他引：18
对白斑综合症杆状病毒（ＷＳＢＶ）致病性特征的研究结果表明,ＷＳＢＶ的致病性与斑节对虾个体大小无关,ＷＳＢＶ的致病力与感染方式和病毒数量有关,在盐度为１４,温度为２８￣３２℃的海水中,游离ＷＳＢＶ在４ｈ内失去感染活性;体长７ｃｍ的白斑综合症死亡斑节对虾,其携带的ＷＳＢＶ在５７ｈ失去感染活性;体长７ｃｍ死亡斑节对虾经２８℃空气干燥,其携带的ＷＳＢＶ在５０ｈ失去感染活性;ＷＳＢＶ不能通过体表感染健康斑节 相似文献
9.
对虾白斑杆状病毒(WSBV)对斑节对虾的实验感染与病理学研究 总被引：1，自引：0，他引：1
用取自发病虾塘患典型白斑病的病虾为毒源 ,对健康斑节对虾Penaeusmonodon进行人工感染 ,按Koch氏法证实了对虾白斑杆状病毒 (WSBV)是白斑病的病原。对人工感染WSBV后患典型白斑病的斑节对虾的胃、肠及皮下结缔组织进行石蜡切片和超薄切片 ,研究WSBV引起的组织病理变化和宿主细胞感染WSBV后的超微病变过程。结果表明 :感染WSBV后病虾的不同组织均存在广泛的变性、坏死 ,上皮细胞大量解体、脱落 ;部分细胞核肿大、游离 ;结缔组织糜烂 ,呈现空泡化 ;未发现包涵体。透射电镜照片显示 :感染WSBV后的病虾在感染前期 ,靶细胞核膨胀 ,核仁消失 ,核外膜破损 ,染色质靠边分布 ,内质网断裂 ,核糖体脱落 ,线粒体肿胀 ,高尔基体萎缩 ,溶酶体空泡化 ;感染中期 ,病毒粒子在细胞核内大量复制 ,直至充满整个核 ,细胞核内无结构化 ,核膜及质膜皱缩 ;感染后期 ,核胀破 ,病毒粒子从核内释放 ,细胞核呈空囊状 ,胞质内髓样结构明显 ,细胞器解体 ,细胞功能丧失。 相似文献
10.
为研究不同类型Toll样受体基因在凡纳滨对虾免疫调控机制中的作用,实验首先通过荧光定量PCR方法检测了凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同组织中的表达情况。结果表明凡纳滨对虾3种Toll样受体基因m RNA在各组织中均有表达。其中,Toll1基因在肌肉,血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,心脏表达量最高;Toll2基因在血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,其中在鳃表达量最高;Toll3基因在鳃和心脏有较高表达,其中在鳃表达量最高。实验还对人工感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同免疫组织的表达变化差异进行研究。感染白斑综合症病毒后凡纳滨对虾血淋巴及鳃中3种Toll样受体基因表达量均显著提高,并在各自达到表达峰值后逐渐下降直至恢复到感染前水平。感染溶藻弧菌后凡纳滨对虾血淋巴中3种Toll样受体基因表达量均显著提高;鳃中Toll1及Toll3表达量分别于感染后3h和12h有显著提高,而Toll2表达量无显著提高。由此推测3种Toll样受体基因均可能参与白斑综合症病毒感染所引起的免疫调控;而在溶藻弧菌感染所引起的免疫调控中,除了Toll1,Toll3参与鳃的免疫调控外,Toll2基因还参与血淋巴中的先天性免疫调控。长期感染白斑综合症病毒或溶藻弧菌后,凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在血淋巴与鳃中的表达量均显著升高,这可能与虾体在长期感染过程中,需要不断保持较高免疫水平有关。 相似文献
11.
Diagnosis of iridovirus in large yellow croaker by PCR 总被引：1，自引：0，他引：1
A rapid and sensitive PCR-based method for the detection of the large yellow croaker iridovirus(LYCIV) is described,which involves the amplification of a 295 bp fragment of the LYCIV ATPase gene from DNA isolated from naturally infected fish spleen.Sequencing of LYCIV ATPase gene fragment showed it shared 100% nucleotide sequence homology with the corresponding region of the ATPase gene of red sea bream iridovirus(RSIV) and sea bass iridovirus(SBIV),suggesting that LYCIV was homologous with RSIV and SBIV at least in part of the gemone.The specificity and sensitivity of the PCR procedure were tested on the iridovirus-infected fishes,the expected fragment was detected from spleen DNA samples of infected fishes,whereas no fragments were amplified from healthy fish spleen DNA,white spot syndrome baculoviruses(WSBV) DNA and pseudorabies virus(PRV) DNA.Detection limit of this method was 10-7 ng positive plasmid DNA containing target sequence,equal to about 100 virions.In the infected experiment,first positive detection(1/4) appeared at Day 3 post-infection,all fish(4/4) tested positive at Day 7,however obvious symptoms were observed at Day 8,so LYCIV infection could be detected prior to the appearance of obvious symptoms.These results indicate that this PCR method could be used for early,rapid and specific detection of LYCIV infection. 相似文献
12.
核酸探针原位杂交检测白斑综合症病毒的组织特异性 总被引：2，自引：0，他引：2
从白斑综合症病毒 (whitespotsyndromevirus ,简称WSSV)部分基因组文库中得到核酸探针 ,采用原位杂交检测方法检测对虾甲壳下表皮、胃、后肠、鳃、触角腺的上皮细胞、淋巴器官的基质细胞、肌细胞、心肌细胞及结缔组织细胞 ,原位杂交结果均为阳性。对虾甲壳下表皮的上皮细胞、胃的上皮细胞对病毒较其它部位敏感 ,感染程度高 ;中肠上皮细胞、肝胰腺上皮细胞、淋巴器官内皮细胞未发现感染病毒 ,原位杂交用于WSSV检测 ,比组织切片HE染色更准确、更敏感。在同一组织的同一部位 ,原位杂交所得到的阳性细胞个数比HE多。探针大小不同 ,敏感性也有变化。短的探针 41 3bp敏感性较高 ,长的探针敏感性降低。 相似文献
13.
二温式多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)的研究与应用 总被引：7，自引：0，他引：7
建立了一种同时检测对虾白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）的二温式多重PCR技术。根据基因库中WSSV（AF369029）和IHHNV（NC002190）基因序列，设计了两对分别与WSSV和IHHNV某段保守基因序列互补的引物，用这两对引物对同一样品中的WSSV和IHHNVDNA模板进行多重PCR扩增，结果均同时得到了两条大小与实验设计相符的593bp（WSSV）和356bp（1HHNV）特异性多重PCR扩增条带，而对其他对虾疾病病原的PCR扩增结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重PCR技术最低能检测到WSSV和IHHNVDNA各100pg。用该多重PCR对400份临床病料进行检测，结果230份检出WSSV，阳性率57．5％；96份检出IHHNV，阳性率24％；56份同时检出WSSV和IHHNV，阳性率14％。18份为阴性，阴性率为4．5％。结果提示了WSSV和IHHNV广泛存在于中国南方的养殖对虾中，作者建立的二温式多重PCR可以用于这两种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。 相似文献
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3种水产病原菌简型基因芯片检测技术的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据水产养殖中常见的3种病原菌鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)及迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的研究资料,筛选3个毒力相关基因toxR、aerA、evpA设计引物和探针,构建简型基因芯片,并使用对虾白斑病综合征病毒(WSSV)variable region的PCR荧光标记产物作为表面化学质控。通过已构建和优化的多重PCR反应条件,获得了3个目的基因的PCR产物;经过芯片制作过程的优化,将探针以终浓度20μmol/L溶于50%DMSO,在室温、相对湿度45%的条件下点印于醛基基片表面。扩增的PCR产物与杂交液混合后,在42℃杂交2 h就可检测到理想的杂交信号。芯片的灵敏度试验结果表明,可以检测到的3种水产病原菌的最低模板DNA为:鳗弧菌3×102拷贝、嗜水气单胞菌5×103拷贝、迟缓爱德华氏菌6×101拷贝。该芯片可成功应用于患病大菱鲆内脏的细菌分离物的鉴定。 相似文献
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用蔗糖密度梯度离心法分离纯化白斑综合症病毒（WSSV）。设计并合成引物，提取WSSV中国株的基因组DNA作为模板，通过PCR，扩增克隆出VP28基因，利用BamHI和EcoRI切点将VP28基因插入克隆载体pUC19 的多克隆位点上，得到VP28基因的重组克隆质粒，对其进行双向DNA测序。测序结果表明，该基因含有615个核苷酸，与GenBank中已有不同来源的WSSV的序列片段同源性为100％。利用BamHI切点将VP28的基因插入到穿梭表达载体启动子PpsbA的下游，EcoRI酶切鉴定，得到正向连接的可在蓝藻表达的重组穿梭表达载体，命名为pRL-VP28。 相似文献
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Penaeidin from Chinese shrimp (Fenneropenaeus chinensis) has proved to be one of the most important antimicrobial peptides in the bodies of animals. The relative quantitative real-time PCR method is developed to study through time, the mRNA expression profile of penaeidin in the muscle and haemoeyte tissue of Chinese shrimp infected with vibrio (Vibrio anguillarum) and WSSV (white spot syndrome virus). Research results showed that the same pathogens infection experiments produced similar gene expression profile in different tissues while different expression profiles appeared in the same tissues infected by different exterior pathogens. In vibrio infection experiments, a “U” like expression profile resulted. Expression levels of ponaeidin increased and surpassed the non-stimulated level, indicating that penaeidin from Chinese shrimp has noticeable antimierobial activities. In WSSV infection experiments, the expression profile appeared as an inverse ““““U““““ with the expression ofpenaeidin gradually decreasing to below baseline level after 24 h.The expression of antimierobial peptides gene in mRNA level in response to virus infection in shrimp showed that international mechanisms ofvirns to haemoeytes and microbial to haemoeytes are completely different. Decline of ponaeidins expression levels may be due to haemoeytes being destroyed by WSSV or that the virus can inhibit the expression ofponaeidins by yet undiscovered modes. The expression profiles of penaeidin in response to exterior pathogen and the difference of expression profiles between vibrio and WSSV infection provided some clues to further understanding the complex innate immune mechanism in shrimp. 相似文献