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1.
《中国海洋大学学报(自然科学版)》2016,(1)
本研究运用硫酸铵盐析法结合Protein A亲和层法从大菱鲆血清中分离、纯化免疫球蛋白IgM。SDS-PAGE分析结果显示,纯化的血清IgM主要有2条蛋白带,分子量分别为78和27kDa,分别为大菱鲆IgM的重链与轻链。以纯化的IgM免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,将融合后的细胞置于含HAT的培养基中培养。利用ELISA和Western blotting筛选杂交瘤,并利用有限稀释法对阳性杂交瘤进行单克隆,最终共获得3株抗大菱鲆血清IgM单克隆抗体,分别命名为1B2、1G4和2A1,抗体分型结果显示3株单抗均属IgG。Western blotting结果显示,单抗1B2和1G4可特异性识别大菱鲆IgM重链蛋白,而单抗2A1则特异性识别轻链蛋白。同时,以制备的腹水单抗1G4结合免疫荧光检测显示,单抗1G4可识别大菱鲆外周血、脾及前肾组织中表面IgM阳性(sIgM~+)细胞;流式细胞术分析显示,大菱鲆外周血、脾和前肾白细胞中sIgM~+细胞比例分别为48.07%,20.05%和18.45%。研究结果显示,制备的抗大菱鲆血清IgM单抗特异性高、反应性强,可为研究大菱鲆免疫系统及免疫应答动态提供有力的工具。 相似文献
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应用荧光抗体技术检测牙鲆体内的河流弧菌 总被引：12，自引：0，他引：12
用灭活的河流弧菌(Vibrio fluvialis)抗原,注射免疫实验兔,制得凝集价为1∶5 120的抗血清。用试管凝集法检测了抗血清的特异性,再用免疫吸附法去除交叉反应,从而得到高效价、高特异性的抗河流弧菌血清。用所制备的抗血清在实验室中建立起河流弧菌荧光抗体检测技术(FAT),在荧光显微镜下可清楚地看到被标记的病原菌,整个检测过程只需3h。用河流弧菌感染牙鲆(Paralichthys olivaceus),24 h后,用FAT测定牙鲆的血液、肾脏和肝脏中的河流弧菌,在血液中河流弧菌的检出率最高,其次是肾脏,肝脏的检出率最低。以上结果表明:荧光抗体技术可以快速、灵敏、准确地检测出牙鲆体内的河流弧菌。 相似文献
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降低交叉反应的鱼类病原菌检测抗体芯片初步研究 总被引：1，自引：0，他引：1
采用菌体吸附法对海豚链球菌(Streptococcus iniae)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、荧光假单胞菌(Psedomonas fluo-rescens)和海洋分支杆菌(Mycobacterium marinum)6种养殖鱼类病原菌的兔抗血清进行吸附,以减小抗血清与其它菌株的交叉反应;吸附纯化后的抗体作为捕获抗体构建了病原菌检测抗体芯片。实验结果显示,与未经过吸附的纯化抗血清构建的抗体芯片相比,血清吸附实验能有效减少交叉反应,降低抗体的非特异性吸附,提高细菌检测的特异性。同时,以迟缓爱德华氏菌为例,采用吸附纯化后抗体制备的抗体芯片检测人工感染迟缓爱德华氏菌和自然发病的牙鲆,均观察到迟缓爱德华氏菌的特异性显色反应,得到了较理想的检测结果。本文结果说明优化后的病原菌检测抗体芯片可用于水产养殖鱼类常见的上述6种细菌性疾病的有效检测。 相似文献
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5.
以杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)为研究对象,通过密度梯度离心方法纯化得到高纯度血蓝蛋白,以其作为抗原皮下注射免疫新西兰大白兔,从而获得高效价的兔源多克隆抗血清。进一步通过Protein A抗原亲和纯化的方法对该抗血清纯化,最终获得效价更高、检测特异性更好的血蓝蛋白多克隆抗体。应用该抗体进行Western检测发现,鲍血淋巴中存在着多样的血蓝蛋白衍生产物;进一步结合质谱技术对其中35 kDa条带进行鉴定发现,其来源于血蓝蛋白I型亚基的H结构域。 相似文献
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间接ELISA技术在病原性鳗弧菌SMP1快速检测中的应用 总被引：2，自引：0，他引：2
以大菱鲆(Scophthalmus maximus)出血症的病原菌——鳗弧菌(Vibrio anguillarum)SMP1为抗原,制备兔抗血清,测定了抗血清的工作浓度和对抗原的特异性,建立了在大菱鲆肝肾组织中检测SMP1的间接ELISA方法。SMP1人工感染大菱鲆,用建立的间接ELISA对大菱鲆肾脏和肝脏进行检测,结果肾脏的阳性检出率为87.7%,肝脏的阳性检出率为90%。该方法的建立有助于快速准确地鉴定由SMP1引起的大菱鲆疾病。 相似文献
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大黄鱼溶藻弧菌LPS的间接ELISA检测 总被引：9，自引：0，他引：9
用酚 水法从20dm3溶藻弧菌培养液中分离得到脂多糖(LPS)97.6mg,以0.5mg cm3的LPS溶液通过耳缘静脉注射免疫实验兔,经过3次加强注射后从颈动脉放血制备抗血清.该抗血清的效价为1∶2560,对副溶血弧菌等10株细菌的交叉反应效价都较低.用免疫吸附过滤法去除血清中的非特异性成分.用吸附后的抗血清进行溶藻弧菌间接ELISA检测,其检测限为97×104个 cm3.以ELISA进行大黄鱼体内溶藻弧菌检测.结果表明:用LPS抗血清可以较为灵敏地检测大黄鱼体内的溶藻弧菌,该方法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病,也可以检测无病症带菌大黄鱼. 相似文献
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瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)卵黄蛋白原的纯化、性质鉴定及ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
腹腔注射17β-雌二醇(E2),使瓦氏黄颡鱼雄鱼在7天内产生卵黄蛋白原(Vtg)。采用凝胶过滤和离子交换两种层析技术,从E2诱导的雄性瓦氏黄颡鱼血浆中分离、纯化出Vtg,采用糖、磷、脂蛋白染色技术证明分离、纯化的蛋白为Vtg,该Vtg在非变性条件下分子量约为240kDa,在SDS变性条件下分子量约为143kDa。纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg经检测显示可能含有类胡萝卜素,但没有二硫键,对热相对稳定。利用纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg,制备了兔抗瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清。用双向免疫扩散法测得抗血清的纯度较高,效价为1︰32;Western blotting检测显示抗血清的特异性较好。以瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清为抗体,以纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg为抗原,建立了间接酶联免疫吸附反应(ELISA)方法检测瓦氏黄颡鱼体内Vtg的含量,标准曲线线性部分的线性方程为y=0.099x+0.4529(R2=0.9327),该方法检测的灵敏度为15.6ng/ml,工作范围为31.2—4000ng/ml,在此范围内,标准曲线具有良好的线性。 相似文献
10.
用制备的迟缓爱德华氏菌灭活全菌和主要外膜蛋白(OMP)对大菱鲆进行腹腔注射及肛门灌注免疫,以Ig+细胞数量及血清抗体效价为指标,评价和比较大菱鲆对不同抗原的免疫应答水平.结果显示,注射2种抗原后,外周血中Ig+细胞数量及血清抗体效价均呈明显增加趋势,注射OMP大菱鲆的外周血Ig+细胞数量及血清抗体效价不显著低于注射灭活全菌大菱鲆(外周血Ig+细胞:P=0.390;抗体效价:P=0.300);肛门灌注2种抗原后,大菱鲆外周血和后肠中Ig+细胞数量及血清凝集效价亦均呈增加趋势,灌注OMP大菱鲆后肠、外周血中Ig+细胞数量和血清抗体效价均不显著高于灌注灭活全菌大菱鲆(外周血Ig+细胞:P=0.056;后肠Ig+细胞:P=0.163;抗体效价:P=0.195).结果表明,注射和肛门灌注迟缓爱德华氏菌灭活全菌和OMP均能够诱导大菱鲆产生针对迟缓爱德华氏菌的特异性免疫应答.本文结果对鱼类疫苗的研制具有参考价值. 相似文献
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一种来自海洋细菌的血纤维蛋白溶酶的分离纯化及性质研究 总被引：2，自引：0，他引：2
利用硫酸铵分级盐析、DEAE－纤维素阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析法对由海洋细菌FE92－8分泌的纤维蛋白溶酶进行了分离纯化，结果得到SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳单一区带。性质研究发现，该酶分子量为12.6kD，等电点为7.45，琼脂糖－纤维蛋白平板法测得该酶作用的最适温度为50℃，最适pH为8.0，在37℃，pH为8.0的情况下表现出很好的稳定性，温度起来50℃热稳定性较差，在碱性环境中稳定性较在酸性环境中稳定性强，阴性平板和阳性平板对比实验发现，该酶只有纤溶活性而无激酶活性，体外实验发现，该酶具有快速溶解血栓的能力。 相似文献
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INTRODUCTIONATislowKWCys-rich(aboutonethird)metal-bindingprotein,lackofaromaticaminoacidresidues.AThasbeenfoundinkidneysandliversofmanymammals,andalsoininvertebrates,microorganismsandplants.ThepresenceofanAT-likeproteinhasbeenfoundinanumberofaquaticorganisms,includingtheplaice(Overnelletal.,1977),rock-fish(Olafsonetal.,1974),goldfish(Marafant,1976),andcrabandshrimp(Olafsonetal.,1979).AThasbecomethesubjectofgreatInterestinrecentyearsduetotheirwideexistenceandmetalaffinity.Scientistsha… 相似文献
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泥螺抗菌肽的初步研究 总被引：2，自引：0，他引：2
将一定浓度的大肠杆菌注射于泥螺体内18h后，将其粘液和血淋巴，于95℃加热10min，10000r／min，4℃离心20min，所得上清液用截留分子量为3kD的超滤装置于10000r／min，4℃下离心1h．滤液用Sephadex G-50分离，得到两个吸收峰．以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为试验菌株检测抑菌活性，结果表明泥螺经大肠杆菌诱导后，在其血淋巴和分泌的粘液中可分离得到抗菌肽，此多肽具有分子量较小，热稳定性好，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均能够起到抑制作用的特点． 相似文献
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本研究将新发现的鳗弧菌毒力相关基因mltD(膜绑定溶胞壁质转糖酶基因)克隆于表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以镍琼脂糖亲和层析柱纯化表达的融合蛋白;经SDS-PAGE分析,纯化的融合蛋白为单一条带,分子量约为70.2 kDa,与理论预测值相符。生物信息学分析表明,鳗弧菌MltD由523个氨基酸组成,与其他弧菌的MltD氨基酸序列有较高的相似性;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;功能区包括N端的信号肽区域、1个糖基转移酶结构域和C端的3个溶解酶结构域;蛋白的N端具有一段脂蛋白信号肽,信号肽外的其他部分为非细胞质蛋白。鳗弧菌MltD蛋白为亲水性;不稳定系数为27.40,属于稳定性蛋白;整个蛋白分子共有24个可能的抗原决定簇,具有较强的抗原性。推断MltD蛋白为1种外周膜脂蛋白,在弧菌中相对保守,抗原性强,可应用于抗弧菌病疫苗的开发研制。 相似文献
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经Tris-HCl缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤,从菲律宾蛤仔内脏团中分离得到碱性磷酸酶,SDS-PAGE显示为单一条带,提纯倍数为14.42,比活力达到131.08U/mg。酶学性质研究表明:该酶亚基分子量约44kD,最适反应温度为45℃,最适pH值为9.0,米氏常数Km为0.098mmol/L,最大反应速度Vmax为1.01μmol/(mL·min)。Ca2+、Mg2+对酶活力表现出显著的激活作用。 相似文献
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采用PCR扩增、构建重组高效表达载体的方法,进行了牙鲆多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的克隆、原核表达研究,并利用SDS-PAGE、western-blot及ELISA方法对纯化的重组蛋白特性进行了分析。结果表明,PCR扩增出pIgR开放阅读框(ORF)基因全长为1005 bp,所构建的pET-32(a)-pIgR重组质粒经PCR和双酶切鉴定含有ORF全长基因。SDS-PAGE结果表明,表达的目的蛋白相对分子质量为58 kDa,与理论预期值一致,IPTG诱导6h后表达量趋于稳定,经亲和层析纯化得到高纯度的重组蛋白。Western-blot结果表明,重组pIgR能够与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应;ELISA结果表明重组pIgR能够与牙鲆IgM发生特异性结合。本研究获得了纯化的重组pIgR,证明其具有IgM结合活性,为下一步研究牙鲆pIgR的转运机制及在黏膜免疫防御中的作用机理提供了分子基础。 相似文献
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肉桂酸-4-羟基化酶是木质素合成反应中的关键酶, 木质素合成反应对于植物耐受重金属胁迫有重要作用。本研究利用同源克隆和cDNA末端快速扩增方法(rapid amplification of cDNA ends, RACE)从红海榄叶片中克隆得到一条肉桂酸-4-羟基化酶基因, 命名为RsC4H, 生物信息学分析结果显示RsC4H基因的cDNA全长为2006bp, 开放阅读框长1572bp, 共编码523个氨基酸。该基因编码蛋白的相对分子质量为60.18kD, 是亲水性的不稳定蛋白, 二级结构以α螺旋(47.42%)和无规则卷曲(32.70%)为主, 该蛋白在N端和C端分别包含一个跨膜结构, 不含有信号肽, 主要在膜结构或内质网上发挥功能, 属于p450超家族。RsC4H蛋白与其他植物的C4H蛋白相似性较高, 系统发育树结果显示其与笋瓜(Cucurbita maxima, XP_023007159.1)、南瓜(Cucurbita moschata, XP_022947682.1)的亲缘关系更近。qRT-PCR结果显示, 红海榄能快速响应重金属胁迫, 提高RsC4H基因的表达量, 促进木质素生成并增加细胞壁厚度以阻止金属离子进入细胞。此研究结果丰富了红树植物抗重金属胁迫基因库, 为从分子水平揭示红海榄耐受重金属胁迫机制提供了基础资料。 相似文献
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栉孔扇贝(Chlamys farreri)中抗氧化肽的分离纯化及性质研究 总被引：6，自引：0，他引：6
以栉孔扇贝内脏团为原料,对其中抗氧化肽的制备、纯化及性质进行了研究。首先采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A-50阴离子交换层析的方法,进行了扇贝提取蛋白的制备,其次采用海洋蛋白酶YS-80水解、SephadexG-25凝胶层析的方法,进行扇贝抗氧化肽的制备,获得多肽粗品(海洋肽,PCF),并进一步采用CM Sepharose阳离子交换层析和反相高效液相色谱的方法,对扇贝抗氧化肽进行了纯化,结果得到组分PCF-3A,反相高效液相显示为单一峰。采用茚三酮反应、Sephadex G-15凝胶层析和AccQ.Tag氨基酸分析柱,进行了PCF-3A的理化性质研究。结果表明,茚三酮反应呈阳性;分子量约为794D;由7种氨基酸组成,分别为天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸和脯氨酸。采用邻苯三酚自氧化体系和Fenton反应体系对PCF-3A的抗氧化活性进行了研究,发现该肽可有效清除羟自由基和超氧阴离子,半抑制浓度(IC50)分别为0.39mg/ml和2.85mg/ml,具有明显的抗氧化、抗衰老作用。 相似文献