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单环刺螠硫醌氧化还原酶的表达、纯化和复性 总被引：2，自引：0，他引：2
硫化物是1种广泛分布的有毒物质。硫醌氧化还原酶(SQR)是硫化物代谢的关键酶。单环刺螠是1种生活在潮间带下区及潮下带中的底栖生物。本研究为了获得具有活性的单环刺螠SQR,将其基因的开放阅读框cDNA克隆到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行重组蛋白的表达,后采用稀释复性的方法对重组蛋白进行复性。经IPTG诱导后该重组蛋白主要以包涵体形式存在。用8 mol/L的尿素溶解包涵体后,通过镍离子金属螯合柱纯化获得重组蛋白。首次通过蛋白复性的方法获得具有活性的单环刺螠SQR,确定最佳稀释复性条件为pH=8.0,蛋白浓度20μg/mL,L-精氨酸浓度0.2 mol/L,还原型谷胱甘肽∶氧化型谷胱甘肽=10∶1,复性时间为96 h。 相似文献
2.
外源性硫化物可通过抑制或阻断线粒体电子传递经典途径而对生物体产生损伤甚至致死,交替氧化酶(Alternative Oxidase,AOX)是线粒体硫化物氧化电子传递分支途径中的1个关键酶。为了研究硫化物环境中单环刺螠的生存对策,本文利用间接竞争性ELISA和酶活性分析等技术检测了单环刺螠在硫化物应激前后中肠和后肠中AOX的蛋白含量以及活性的变化。结果显示:在未处理的单环刺螠中,后肠的AOX蛋白含量和酶活性均高于中肠。当单环刺螠暴露在硫化物(50和150μmol·L-1)环境中时,2个器官的AOX含量和酶活性水平均随着硫化物浓度的提高和暴露时间的延长而提高,并且150μmol·L-1硫化物处理组的单环刺螠2个器官AOX蛋白含量和酶活性普遍高于相同处理时间下的50μmol·L-1组。结合已报道的单环刺螠硫化物应激下细胞色素c氧化酶活性的变化,提出单环刺螠体内存在线粒体电子传递分支途径;提高组织线粒体中AOX活性是其应对环境硫化物毒性的对策之一。 相似文献
3.
《海洋湖沼通报》2017,(2)
Caspase-3是细胞凋亡过程中的关键执行蛋白。本文采用RACE技术克隆了单环刺螠Caspase-3cDNA序列,其全长为1616bp,开放阅读框长759bp,编码252个氨基酸,其中含有Caspase家族保守的结构域(QACRG)和Caspase-3两个特异的切割位点(D96-L97、D135-S136)。体外原核诱导表达获得Caspase-3重组蛋白并制备其多克隆抗体。免疫印迹(Western Blot)检测结果显示,单环刺螠暴露在50μmol/L硫化物环境中,其呼吸肠Caspase-3蛋白含量未见显著变化;而当单环刺螠暴露在150μmol/L硫化物环境中时,其呼吸肠中Caspase-3蛋白的含量于暴露后24h显著提高,暴露72h其含量是同时间对照组的1.8倍。表明低浓度的硫化物对单环刺螠呼吸肠细胞的存活没有明显影响,而高浓度硫化物的长期暴露可能对单环刺螠呼吸肠细胞产生一定程度的致死影响。 相似文献
4.
为评价单环刺螠纤溶酶(UFEⅠ)的抗凝血和抗血栓形成作用,并对其免疫原性进行初步研究.文中通过小鼠血液凝固时间实验和大鼠颈动脉血栓形成模型研究UFE Ⅰ抗凝血和抗血栓作用.用纯UFE Ⅰ为抗原免疫小鼠,间接ELISA法测定特异性抗体的动态变化及效价.结果UFE Ⅰ能明显延长小鼠凝血时间,有效抑制大鼠体内的血栓形成,并显著降低大鼠纤维蛋白原含量(FIB),延长活化部分凝血活酶时间(APTT).免疫原性的研究结果为UFE Ⅰ末次免疫小鼠后,产生微量特异性抗体,且抗体水平呈现先升后降的动态变化;方阵法确定了ELISA的优化条件,测定UFE Ⅰ免疫后产生的抗体效价为1∶1 280.本文研究显示,单环刺螠纤溶酶UFEⅠ具有显著的抗凝血和抗血栓形成作用,在小鼠体内产生一过性抗体,但对动物机体不造成负面影响. 相似文献
5.
硫化物是沿海水域中常见的有害物质,对于多数生物来讲,其在微摩尔级水平便可导致生物体中毒。硫醌氧化还原酶(SQR)是一种谷胱甘肽还原酶家族的膜结合黄素蛋白,为硫化物氧化解毒的一种关键酶。本研究以体外原核表达并复性的单环刺螠SQR为材料,采用His-pulldown技术和SDS-PAGE分析,从单环刺螠体壁细胞裂解液中筛选出两个可能与SQR结合的蛋白质,分子质量分别为40 ku和60 ku。通过毛细管液相色谱-离子肼质谱分析,初步判断其为细胞色素P450(cytochrome P450)和腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter),并初步探讨了其可能的功能。 相似文献
6.
Bcl-xL是Bcl-2家族中一类重要的抗凋亡因子,其功能主要是抑制细胞凋亡、促进肿瘤发生。为了探知Bcl-xL在生物硫化物应激中的作用,本实验以耐硫生物单环刺螠(Urechis unicinctus)为研究对象,RACE扩增获得一个长度为1 426 bp的单环刺螠Bcl-xL全长c DNA序列,推导的氨基酸序列包含Bcl-xL4个保守的BH结构域和1个跨膜区域。使用该c DNA的完整开放阅读框序列,构建了原核表达载体p ET28a-Bcl-xL,体外诱导表达该重组蛋白;镍柱纯化得到纯度为90%的纯化蛋白,并制备多克隆抗体。Western blotting结果显示:单环刺螠暴露于50μmol/L硫化物中2 h-24 h内其呼吸肠中Bcl-xL含量显著增加(P0.05),然而在150μmol/L硫化物中48 h-72 h内其呼吸肠Bcl-xL含量显著降低(P0.05),暗示Bcl-xL抑制细胞凋亡途径在单环刺螠应对低浓度硫化物暴露时发挥作用,而在高浓度硫化物暴露下Bcl-xL不能发挥抑制细胞凋亡的作用。 相似文献
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对患病的单环刺螠幼体3 000～4 000只/kg肠道内病原菌进行分离鉴定、生长特性研究及药敏分析,为人工养殖单环刺螠幼体过程中出现的疾病提供治疗依据。对患病幼体肠道内的病原菌进行分离纯化、生理生化鉴定、16S rRNA基因序列分析、人工回接感染试验、生长曲线测定、最适生长温度、pH、盐度的探究;采用K-B纸片扩散法对米诺环素、庆大霉素、卡那霉素、头孢唑林、四环素中度敏感,对阿奇霉素、新霉素、万古霉素、利福平、红霉素、克林霉素、阿莫西林进行药敏试验;并对抑菌效果最好的药品进行安全性检测。分离纯化后经生理生化鉴定获得一种弧菌命名为菌株SX-1,16S rRNA基因序列分析极有可能为新喀里多尼亚弧菌(Vibrioneocaledonicus),人工回接感染试验表明SX-1是单环刺螠幼体从沙底钻出,活动能力减弱,体表变红症状的致病菌,生长特性研究表明其最适生长温度、pH、盐度分别为30℃, 6.0, 35;药敏试验结果表明, SX-1对氯霉素、羧苄西林、氧氟沙星、头孢曲松高度敏感,安全性检测实验表明,氧氟沙星抑菌治疗效果明显,并对单环刺螠无伤害。从单环刺螠肠道内分离获得了一种极有可能为新喀里多尼亚弧菌(Vibrio neocaledonicus)的致病菌SX-1。对于感染该种弧菌的单环刺螠,氧氟沙星抑菌治疗效果明显,并对单环刺螠无伤害。我们的实验结果对于预防并治疗人工养殖过程中单环刺螠患病提供理论依据和治疗模式,因而具有实际指导意义。 相似文献
8.
久效磷对单环刺螠体内几种酶活性影响的初步研究 总被引：1，自引：0，他引：1
运用冰冻切片技术和酶组织化学的方法研究了长期暴露于不同质量浓度久效磷(0,50,100,150ng/L)下的单环刺螠(Urechisunicinctus)体内的乙酰胆碱酯酶(AChE)、细胞色素C氧化酶(CCO)、碱性磷酸酶(AKP)的活性变化。实验表明,AChE在单环刺螠的体壁上呈现出较强的酶活性,活性位点处为红棕色的颗粒沉淀、并随久效磷胁迫浓度的提高显色越来越深;消化道切片上基本上没有AChE的活性。CCO在单环刺螠的体壁及肠道上都呈现出较强的酶活性,活性位点显示为棕色;肠道上,不同质量浓度组由低到高其CCO活性位点依次增多、显色也依次加深。低质量浓度久效磷(<150ng/L)胁迫对单环刺螠体内的AKP活性没有明显的影响。 相似文献
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《中国海洋大学学报(自然科学版)》2016,(2)
JNK通路是MAPK信号通路的子通路之一,参与生物体的多种应激反应。本研究分析了单环刺螠JNK分子的特征,并对50和150μmol/L硫化物应激下单环刺螠呼吸肠中JNK的反应进行了研究。单环刺螠JNKcDNA全长2 102bp,编码403个氨基酸,推导的氨基酸序列具有JNK家族的典型特征。Western blot(蛋白免疫印迹)检测显示,单环刺螠呼吸肠中JNK总蛋白数量在硫化物暴露期间未见明显的变化;当单环刺螠暴露于硫化物环境中时,其呼吸肠细胞中磷酸化JNK的含量呈现显著性地持续升高趋势,其起始显著升高发生在单环刺螠暴露0.5h,随着暴露时间的延长,磷酸化JNK的含量持续升高,并在150μmol/L硫化物暴露48h时其含量增至最高,为对照组的10.2倍;此外,暴露于50μmol/L硫化物中的单环刺螠呼吸肠磷酸化JNK含量普遍低于150μmol/L硫化物相同暴露时间的磷酸化JNK的含量。研究结果表明,单环刺螠JNK基因拥有进化保守性,且JNK信号通路在单环刺螠呼吸肠应对硫化物中发挥作用。 相似文献
10.
《中国海洋大学学报(自然科学版)》2017,(7)
斑马鱼卵黄原蛋白(Vitellogenin,VTG)是检测环境雌激素活性的重要生物标志物。为了确定最佳的斑马鱼VTG检测方法,本研究利用纯化的斑马鱼VTG及其多克隆抗体同时建立了竞争ELISA与夹心ELISA,并比较了2种方法对VTG的敏感度与精确度。采用凝胶过滤与离子交换层析相结合的方法从17β-雌二醇暴露后的斑马鱼整体匀浆液中纯化获得了2种高分子量的糖磷脂蛋白,SDS变性电泳显示分子量为180与143kDa的两条主带,证实纯化的蛋白为斑马鱼VTG。Western blot结果表明制备的抗血清对斑马鱼VTG具有很高的特异性,利用纯化的VTG及其多克隆抗体建立了定量斑马鱼VTG的竞争ELISA和夹心ELISA。与竞争ELISA相比,夹心ELISA不需要抗原抗体共孵育的过程,操作更加省时、简便,其工作范围为3.9~250ng/mL,检出限约为2.2ng/mL,组内与组间变异系数则分别为2.1~5.7和3.0~7.3,表现出更高的敏感度与精确度,推荐该方法用于环境雌激素活性的检测。 相似文献
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瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)卵黄蛋白原的纯化、性质鉴定及ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
腹腔注射17β-雌二醇(E2),使瓦氏黄颡鱼雄鱼在7天内产生卵黄蛋白原(Vtg)。采用凝胶过滤和离子交换两种层析技术,从E2诱导的雄性瓦氏黄颡鱼血浆中分离、纯化出Vtg,采用糖、磷、脂蛋白染色技术证明分离、纯化的蛋白为Vtg,该Vtg在非变性条件下分子量约为240kDa,在SDS变性条件下分子量约为143kDa。纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg经检测显示可能含有类胡萝卜素,但没有二硫键,对热相对稳定。利用纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg,制备了兔抗瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清。用双向免疫扩散法测得抗血清的纯度较高,效价为1︰32;Western blotting检测显示抗血清的特异性较好。以瓦氏黄颡鱼Vtg多克隆抗血清为抗体,以纯化的瓦氏黄颡鱼Vtg为抗原,建立了间接酶联免疫吸附反应(ELISA)方法检测瓦氏黄颡鱼体内Vtg的含量,标准曲线线性部分的线性方程为y=0.099x+0.4529(R2=0.9327),该方法检测的灵敏度为15.6ng/ml,工作范围为31.2—4000ng/ml,在此范围内,标准曲线具有良好的线性。 相似文献
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条斑紫菜锰超氧化物歧化酶原核表达及多克隆抗体制备 总被引：1，自引：0，他引：1
研究紫菜抗逆的分子机制,将本实验室克隆的条斑紫菜(Porphyra yezoensisUeda)锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn SOD)基因全长cDNA克隆到质粒pET-30c(+)中,构建原核表达载体pET-S,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达Mn SOD,表达产物的分子量约为30 KDa。利用不同浓度的Mn2+诱导重组Mn SOD的表达,可以检测到比活力随Mn2+浓度增高而上升的趋势。用重组Mn SOD免疫新西兰大白兔,制备了多克隆抗体,多克隆抗体的效价为1∶8 000。免疫印迹实验(Western Blot)表明该多克隆抗体具有很好的特异性。 相似文献
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芳香化酶Cyp19a在鱼类性别决定和性别分化中起关键作用,通过调控体内雌、雄激素的转化来影响鱼类性别表型形成。为深入研究Cyp19a在牙鲆(Paralichthys olivaceus)性腺分化和发育过程中的表达规律及作用机制,本文从牙鲆cDNA中克隆获得1557bp的cyp19a基因编码序列,并成功构建了原核重组表达质粒。经体外重组与纯化获得较高纯度的重组Cyp19a蛋白;以此作为抗原免疫兔子,制备多克隆抗体。用间接酶联免疫吸附剂测定(ELISA)技术检测抗血清效价,评估其免疫原性。结果表明免疫结束后得到的抗体血清效价超过了1∶50000,且纯化后抗体具有较好活性。Western Blot(WB)检测结果表明Cyp19a兔多抗可以特异性识别牙鲆重组Cyp19a蛋白和内源性Cyp19a蛋白。蛋白水平的雌雄性腺差异表达分析显示,牙鲆Cyp19a蛋白在卵巢中高表达,在精巢中微量表达。利用Foxl2和Dmrt1重组蛋白处理牙鲆性腺分化期幼鱼可分别显著上调和下调Cyp19a的表达(P<0.05)。综上所述,本研究成功制备了牙鲆Cyp19a多克隆抗体并进行了应用,为深入研究牙鲆等鱼类性别分化机制提供有力工具。 相似文献
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检测海洋弧菌的酶联免疫吸附试验研究 总被引：1，自引：0，他引：1
研究建立中国对虾病原菌┐副溶血弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）的间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）快速检测技术。间接ＥＬＩＳＡ技术中的副溶血弧菌的特异抗血清由家兔制备，羊抗兔ＩｇＧ用碱性磷酸酶标记，酶的底物为对磷酸基硝基苯。将该技术标准化后，测定了抗血清与１３株其它副溶血弧菌菌株及２９株其它弧菌标准菌株的交叉反应，并进行了苗期对虾样品中副溶血弧菌的检测 相似文献
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单环刺螠生殖腺的发生及雌体的生殖周期 总被引：2，自引：0，他引：2
采用组织学方法观察单环刺螠(Urechis unicinctus)生殖腺的发生、卵巢的结构及其年周期变化.结果显示:3.5cm幼螠中,原始生殖细胞迁至后肠管壁外的结缔组织膜处,并数个集群与该处的体细胞共同构成性腺原基;至4 cm幼螠,性腺初具雏形;随着个体的生长和成熟,构成卵巢的细胞不断增殖,于虫体尾部后肠腹侧形成长条形膜状的卵巢,外周为卵原细胞,中央为结缔组织,其两端分别与后肠管壁外侧和体壁内侧相连.根据卵巢的组织学和体腔液中雌性生殖细胞的细胞学特征,单环刺螠的卵巢发育可划分为增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期5个时期.单环刺螠生殖腺为低等的定型类型,其卵巢成熟期较生殖期早半个月. 相似文献
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Polyclonal antibodies against three red tide algae with different size, Heterosigma akashiwo, Gymnodinium sp and Alexandrium catenella were raised in this study. Block affinity treatment was done to enhance the specificity of the antibodies. The titer of three polyclonal antibodies was determined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay, and the specificity against polyclonal antibody was determined by indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assy(icELISA). The result showed that Heterosigma akashiwo and Gymnodinium sp antibodies without block treatment got titer higher than 1:32000 and 1:10000, respectively, an indicating of high affinity antibodies. The titer of Alexandrium catenella antibody reached 1:2500, relatively lower than the previous two. The specificity of three polyclonal antibodies after affinity treatment was raised remarkably. However, the titer declined. All the polyclonal antibodies showed a high affinity with their own cells. Polyclonal antibodies were not remarkable cross reacted with other algae in the icELISA, The antibody of Alexandrium catenella reacted to its own cells, no cross activity was found with Alexandrium tamarense, which will be applicable in distinguishing species within the genus. The immunology technique was specific, sensitive and simple with low expend. This was provide a valuable tool for further experiment and had signafication to qualitative and quantitative monitoring of red tide algae. 相似文献
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采用PCR扩增、构建重组高效表达载体的方法,进行了牙鲆多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的克隆、原核表达研究,并利用SDS-PAGE、western-blot及ELISA方法对纯化的重组蛋白特性进行了分析。结果表明,PCR扩增出pIgR开放阅读框(ORF)基因全长为1005 bp,所构建的pET-32(a)-pIgR重组质粒经PCR和双酶切鉴定含有ORF全长基因。SDS-PAGE结果表明,表达的目的蛋白相对分子质量为58 kDa,与理论预期值一致,IPTG诱导6h后表达量趋于稳定,经亲和层析纯化得到高纯度的重组蛋白。Western-blot结果表明,重组pIgR能够与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应;ELISA结果表明重组pIgR能够与牙鲆IgM发生特异性结合。本研究获得了纯化的重组pIgR,证明其具有IgM结合活性,为下一步研究牙鲆pIgR的转运机制及在黏膜免疫防御中的作用机理提供了分子基础。 相似文献
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Dot enzyme-linked immunosorbent assay （dot-ELISA）, indirect ELISA and Westem blot were performed to detect the virulent protease secreted by Vibrio anguillarum which was isolated from the diseased left-eyed flounder, Paralichthys olivaceous. Sensitivity results showed that dot-ELISA is a more sensitive, rapid and simple technique for the protease detection. The minimal detectable amount of protease is about 7 pg in the dot-ELISA test, while 7.8 ng in the indirect ELISA and 6.25 ng in the Westem blot respectively. Protease could be detected 2 h after incubation of V. anguillarum in the 2216E liquid medium but enzyme activity was very low at that period. From 6 to 12 h, the amount and enzyme activity of protease increased markedly and reached maximum at stationary phase. Analysis of serum samples periodically collected from the infected flounders showed that after 2 h of infection by V. anguillarum, the pathogenic bacteria could be detected in the blood of the infected flounders but no protease was found. It was 5-6 h after infection that the protease was detected in blood and then the amount increased as infection advanced. Quantitative detection of protease either incubation in the medium or from the blood of infected flounders could be accomplished in virtue of positive controls of quantificational protease standards （＂marker＂） so that the alterations ofprotease secretion both in vitro and in vivo could be understood generally. In addition, the indirect ELISA and dot-ELISA were also performed to detect V. anguillarum cells. Results indicated that the sensitivity of indirect ELISA to bacteria cells is higher than that of the dot-ELISA, and that the minimal detectable amount is approximately 10^4 cell/mL in the indirect ELISA, while 10^5 cell/mL in the dot-ELISA. 相似文献