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螺旋藻细胞内较高的胞内核酸酶活性是外源基因转化螺旋藻的主要障碍。以供体质粒pEUTISI为酶消化底物，通过多种方法处理螺旋藻细胞，然后检测其内核酸酶粗提液对pEUTISI的降解作用，结果表明，2mmol/L以上的EDTA处理16h或无Mg^2 螺旋藻培养基培养72h以上，都可使处于对数生长期的螺旋藻胞内核酸酶活性显降低；低于28℃（如24℃）培养也可降低螺旋藻的胞内核酸酶活性。根据实验结果，建议在螺旋藻转化前72h开始低温、无Mg^2 培养，转化前16h提高培养基中EDTA的浓度至2mmol/L，就能获得胞内核酸酶活性极低的受体藻，有利于外源基因的转化。 相似文献
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假单胞菌(Pseudomonas sp.cn 4902)甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因克隆及表达 总被引：1，自引：1，他引：1
参照几种生物的甘露醇—1—磷酸脱氢酶基因(mtl D)的序列设计引物，以极端耐盐的假单胞菌(Pseudomonas sp．cn 4902)的总DNA为模板，采用PCR扩增、构建重组高效表达载体以及生物信息学研究等方法，进行基因克隆、表达及功能定性等研究。结果表明，克隆获得一长为1149bp的基因。经蛋白质保守区域研究，初步判别该基因为mtl D结构基因。将该基因与pBV220质粒构建成高效表达原核重组载体pBH。SDS—PAGE电泳表明，含pBH的转化子产生特异的、分子量约为41kD的蛋白带，表达量约占菌体可溶性蛋白6．7％。转化子的耐盐水平比对照提高了约1／5。在含0．9mol／L NaCl的液体培养基中，转化子培养24h后其生物量约是对照的10．2倍，甘露醇含量约是对照的4．1倍。可见，假单胞菌的甘露醇—1—磷酸脱氢酶基因是一个重要的耐盐相关基因，该基因已在GenBank登记，代号为AY112696。 相似文献
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核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶(RubisCO)(EC4.1.139)是光合细菌通过卡尔文循环固定二氧化碳的关键酶。本文采用PCR方法,从沼泽红假单胞菌株No.9中克隆到RubisCO基因(cbbM)序列(该序列已提交GenBank,登录号:GU061327)。采用同源建模法,建立了该RubisCO蛋白的三维结构模型,预测其活性位点。将cbbM基因亚克隆到表达载体pTV118N上,构建表达质粒pTV-CBBM,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株BL21(DE3)/pTV-CBBM,该菌株经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE检测。采用气相色谱法测定破菌上清中的RubisCO酶活。结果表明:①cbbM基因编码461个氨基酸,与沼泽红假单胞菌株DCP3和DH1的RubisCO蛋白序列相似性分别为98%和99%;②推测沼泽红假单胞菌No.9中RubisCO蛋白的活性中心由Asn112、Lys192、Asp194、Glu195、His288、Arg289、His322、Gly424、Ser369、Gly370和Gly394等氨基酸残基组成;③重组蛋白分子量约为50kDa左右,与预测相符;④破菌上清中的RubisCO酶比活高于原始菌株中的酶活,说明目的基因在大肠杆菌中得到了有效表达。 相似文献
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海洋球石藻Emiliania huxleyi是一种全球广泛分布的真核浮游植物,该种不仅是海洋碳、硫循环和全球气候变化的重要指示物种,而且能够产生丰富的次级代谢生物活性物质,在生物技术领域也具有很好的应用前景。本文通过分析氨苄青霉素、卡那霉素、G418、氯霉素、链霉素、新生霉素及嘌呤霉素等7种常用抗生素对海洋球石藻生长的影响,确定G418可作为该藻阳性转化藻株的抗性筛选试剂,其对应的抗性基因neo则作为该藻表达载体构建中的抗性筛选标记。在此基础上克隆了绿色荧光蛋白基因gfp、抗性标记基因neo及E. huxleyi BOF92内源性岩藻黄素-叶绿素a/c结合蛋白基因的启动子fcp,以pUC18为基础载体,构建了pUC18-fcp-gfp和pUC18-fcp-neo两个重组表达载体,以电转化方法共转化球石藻细胞并结合选择性固体培养基筛选,成功获得了被转化的球石藻细胞。海洋球石藻遗传转化系统的建立为进一步开展该种相关的基础生物学研究及其在生物技术领域的应用奠定了基础。 相似文献
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利用同源重组质粒pUTK转化蓝藻Synechococcus sp.PCC7942及胸腺素α1的表达 总被引：5，自引：0，他引：5
采用本实验室构建的丝状蓝藻Calothrixsp.PCC7601基因整合平台系统供体质粒pUTK转化单胞蓝藻Synechococcussp.PCC7942,通过抗性筛选获得了具卡那霉素抗性的转化藻株.经Southem杂交证实pUTK部分序列已整合到Synechococcussp.7942染色体DNA上;红光诱导后通过蛋白质SDS-PAGE电泳,Westernblot证实pUTK的胸腺素α1基因得以有效表达,表达量达到总蛋白的4.8%.结果表明,基因整合平台系统供体质粒pUIK不仅可转化丝状蓝藻Calothrixsp.PCC7601,还可转化单胞蓝藻SynechococcussP.PCC7942. 相似文献
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采用本实验室构建的丝状蓝藻Calothrixsp.PCC7601基因整合平台系统供体质粒pUTK转化单胞蓝藻Synechococcussp.PCC7942,通过抗性筛选获得了具卡那霉素抗性的转化藻株。经Southern杂交证实 pUTK部分序列已整合到Synechococcussp.7942染色体DNA上 ;红光诱导后通过蛋白质SDS PAGE电泳 ,Westernblot证实 pUTK的胸腺素α1 基因得以有效表达,表达量达到总蛋白的4.8 %。结果表明,基因整合平台系统供体质粒 pUTK不仅可转化丝状蓝藻Calothrixsp.PCC7601,还可转化单胞蓝藻Synechococcussp.PCC7942。 相似文献
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通过分析比较 2个螺旋藻物种 7个品系胞外和胞内核酸酶活性 ,确定了抑制胞外和胞内核酸酶活性的方法。用液体培养基清洗两次可消除胞外核酸酶活性 ,添加 EDTA(2 m mol L-1)可显著地抑制胞内核酸酶活性。高温 (6 5℃ )处理也能显著抑制胞内核酸酶活性 相似文献
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钝顶螺旋藻部分原生质体及单细胞的制备与培养 总被引：21，自引：0，他引：21
于1992年1月-1994年4月，进行超声波处理方法制备钝顶螺旋藻部分原生质体以作为基因工程受体，以及制备单细胞用于固体平板克隆化培养的研究。研究结果表明：超声波以20kHz频率、15W功率作用30s，可使藻丝体断裂成15．0±1．6个细胞长度；延长作用时间，至2－6个细胞长度时，细胞壁结构遭到破坏，形成部分原生质体；继续作用，可形成少量原生质体和大量单细胞。断裂藻丝体、部分原生质体、单细胞以及原生质体均可涂布于固体培养基上再生或生长。以一定密度涂布单细胞与原生质体，能够形成彼此分开的单个克隆，可用于筛选及遗传分析。本文提供了一种节省溶菌酶的制备螺旋藻透性体的方法，超声波作用利于外源基因的导入，而涂布培养利于进一步的筛选和形成克隆。 相似文献
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从实验室保存的pBS-Trx重组质粒中克隆球石藻病毒EhV-Trx基因,构建毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-EhV-Trx,将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,诱导分泌表达并对重组蛋白进行二硫键还原酶活性分析。结果表明,EhV-Trx基因开放阅读框为591bp,编码197个氨基酸;在毕赤酵母GS115中成功诱导表达重组EhV-Trx,经SDS-PAGE分析目的蛋白分子量约为27.8kDa;重组EhV-Trx具有二硫键还原酶的活性,能有效打开胰岛素A、B两条链的二硫键,有望开发成一种新型的硫氧还蛋白脱敏制剂应用于食品安全领域。 相似文献
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Δ5脂肪酸去饱和酶(Δ5fatty acid desaturase)是合成花生四烯酸(AA)和EPA的关键酶。为了构建三角褐指藻Δ5脂肪酸去饱和酶基因(简称D5)的原核表达重组质粒,并实现在E.coli BL21(DE3)中的表达。本研究根据GenBank中三角褐指藻Δ5脂肪酸去饱和酶基因序列,设计引物,扩增该基因并插入到pET28a中,测序鉴定后,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物。结果表明pET28a-D5构建成功,IPTG能诱导D5特异性表达。 相似文献
12.
从刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)滋养体/包囊前体c DNA文库中筛选出了甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Ci GAPDH),定点诱变Ci GAPDH基因开放阅读框内的非通用密码子后,构建其原核表达载体p GEX-4T-3/Ci GAPDH,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基硫式-B-D-半乳糖苷诱导表达,结果大肠杆菌成功表达了r Ci GAPDH蛋白。用抗r Ci GAPDH蛋白的鼠血清进行免疫印迹分析,结果抗血清能够识别刺激隐核虫各期虫体的天然Ci GAPDH蛋白,其表观分子质量为37.3 ku,与根据氨基酸序列推算的理论值相符;实验表明r Ci GAPDH蛋白具有很好的免疫原性,而且Ci GAPDH在生活史的各阶段均有表达,符合持家基因的特征。利用间接免疫荧光抗体实验(IFAT)检测天然Ci GAPDH蛋白在刺激隐核虫幼虫上的定位,结果表明天然Ci GAPDH蛋白主要分布在幼虫的细胞质内,且在胞口位置分布最多。对Ci GAPDH的进一步研究可能为刺激隐核虫感染的药物靶点的寻找多条线索。 相似文献
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为筛选与草鱼呼肠孤病毒GCRV096 VP6发生相互作用的宿主蛋白,先将VP6基因的PCR扩增产物,克隆至酵母表达载体p GBKT7以构建其诱饵质粒(p GBKT7-VP6);再将酵母菌Y2HGold(含p GBKT7-VP6)与酵母菌Y187[含草鱼肾脏细胞(CIK)c DNA文库质粒]进行人工诱导融合,然后经选择培养筛选阳性克隆。结果共筛选到4株阳性克隆,经测序、生物信息学分析,分别属于两条不同的核苷酸序列,其中之一所编码的产物与GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)同源性较高。可见,该酶极可能在GCRV096侵染宿主的初期发挥着重要作用。 相似文献
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海洋聚磷菌中核苷二磷酸激酶基因的克隆及序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
以海洋聚磷菌Halomonas YSR-3的总DNA为模板,用PCR法扩增核苷二磷酸激酶基因,将扩增片段克隆到pGM．T载体,转化Escherichia coli TOP10菌株,经蓝白斑筛选、菌落PCR得到阳性克隆,测序后对序列进行Blast比对分析。得到的基因序列长度为420bp,翻译后的序列与Loktanella vestfoldensis SKA53,Jannaschia sp．CCS1,Roseobacter sp．CCS2的核苷二磷酸激酶蛋白序列相似性分别为89％,86％,85％。 相似文献
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肌肉生长抑制素抑制动物肌肉的生长发育.根据本实验室克隆的大黄鱼（Pseudosciaena cro-cea）肌肉生长抑制素（MSTN）基因编码序列设计引物,用RT-PCR扩增目的片段,构建MSTN-pET-28 a重组表达质粒,将其转化到大肠杆菌BL21上并用1.0 mmol/dm3IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测该目的蛋白大小约为44 kDa,与理论值大小符合.用0.25 mol/dm3KCl染色后从凝胶中切取该蛋白且回收.该回收蛋白与弗氏佐剂等量混合后注射ICR小鼠制备多克隆抗体,并用Westernblot检测该抗体.免疫印迹结果在44 kDa的位置上出现棕色条带,表明大黄鱼肌肉生长抑制素的多克隆抗体制备成功.这为今后对肌肉生长抑制素功能的研究奠定了基础. 相似文献
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初筛表明,一株分离自北极加拿大海盆海冰心芯样品的海单胞菌(Marinomonas sp.BSi20584)具有较高的β-D-半乳糖苷酶活性,为了研究清楚其酶学性质,将经hiTAIL-PCR扩增得到的β-D-半乳糖苷酶基因(galt)与pET-28a(+)原核表达载体结合,转入大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导后对重组β-D-半乳糖苷酶(GALT)的表达条件进行了优化,采用金属螯合亲和层析技术制备纯酶,并对重组GALT的酶学性质进行了研究。结果显示,重组酶的最适诱导温度为20℃,在IPTG浓度为0.07mmol/L时诱导22h后,酶活和产酶量达到最大值。GALT单体分子量约为6.6×104 g/mol,天然酶为同源三聚体。GALT最适作用温度为35℃,其热稳定性较好,在60℃处理5h后,仍可保持50%以上的相对活性。GALT的最适作用pH为9.0,在pH为6.0~11.0范围内比较稳定。GALT的最适NaCl浓度为0.5mol/L,对盐度具有较高的耐受性。Mg2+、K+、DTT和EDTA对酶活不具有显著影响,而Mn2+、Fe2+对酶活有促进作用,Zn2+和L-谷胱甘肽对酶活有抑制作用。GALT对Galβ1-4GlcNAc具有水解作用,而对Galβ1-3GalNAc和Galβ1-3GlcNAc糖苷键型没有水解能力。本研究实现了海单胞菌属菌株的β-D-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌系统中的高效表达,并系统研究了重组酶的酶学特性,为后续开展该酶的代谢适应性和潜在应用研究提供详细的酶学数据基础。 相似文献
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用蔗糖密度梯度离心法分离纯化白斑综合症病毒（WSSV）。设计并合成引物，提取WSSV中国株的基因组DNA作为模板，通过PCR，扩增克隆出VP28基因，利用BamHI和EcoRI切点将VP28基因插入克隆载体pUC19 的多克隆位点上，得到VP28基因的重组克隆质粒，对其进行双向DNA测序。测序结果表明，该基因含有615个核苷酸，与GenBank中已有不同来源的WSSV的序列片段同源性为100％。利用BamHI切点将VP28的基因插入到穿梭表达载体启动子PpsbA的下游，EcoRI酶切鉴定，得到正向连接的可在蓝藻表达的重组穿梭表达载体，命名为pRL-VP28。 相似文献
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利用酵母双杂交系统筛选草鱼呼肠孤病毒NS38相互作用蛋白 总被引：2，自引：0，他引：2
采用酵母双杂交技术,对草鱼呼肠孤病毒096(GCRV096)非结构蛋白NS38相互作用的蛋白进行了筛选,并对阳性克隆中的插入序列进行测序与生物信息学分析。结果表明,含有重组质粒pGBKT7-NS38的酵母菌Y2HGold与含有草鱼肾脏细胞(CIK)cDNA文库质粒的酵母菌Y187融合成功,并筛选得到3株阳性克隆;发现两条不同的插入序列,其中一条序列编码的蛋白与40S核糖体蛋白S16亚基的同源性高达99%,而另一序列相应的蛋白不存在匹配的蛋白。该结果为进一步深入研究NS38蛋白在GCRV096复制过程中的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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方形网纹溞(Ceriodaphnia quadrangula)可作为研究水生动物生物学的良好模式动物。为探索细菌介导表达的双链RNA(dsRNA)对方形网纹溞进行RNA干扰(RNAi)技术是否可行,本研究构建了方形网纹溞肌动蛋白(actin)基因的干扰载体Actin-L4440,并将其转入大肠杆菌HT115。此宿主菌经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后能表达actin基因部分片段的dsRNA。将此宿主菌投喂方形网纹溞,能抑制其体内actin基因的表达,并导致方形网纹溞死亡率明显提高。本研究成功构建了方形网纹溞的RNAi模型,为以后的研究提供了一定的参考。 相似文献