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1.
为探究蓝藻藻胆体核心色素蛋白-别藻蓝蛋白单个亚基的光学活性和功能,本研究克隆了钝顶节旋藻(Arthrospira platensis FACHB314)中的脱辅基别藻蓝蛋白基因apcAB及其亚基基因apcA和apcB。节旋藻基因组中apcAB全长共1 056 bp,由apcA和apcB串联组成,中间间隔84 bp。其中,apcA和apcB基因的全长均为486 bp,且均编码161个氨基酸,预测分子量分别约为17.39和17.33 kDa,它们分别编码的α和β亚基均属于Globin＿like超级家族,系统进化树分析显示其氨基酸序列在蓝藻和节旋藻中较为保守。将克隆出的亚基基因apcA、apcB分别同前期A.platensis FACHB314中获得的藻蓝胆素合成相关基因ho和pcyA以及色基裂合酶基因(cpcE、cpcF、cpcU、cpcS、cpcT)共同转化至大肠杆菌中,获得重组别藻蓝蛋白亚基菌株E.coli HPEFUSTA、E.coli HPEFUSTB。SDS-PAGE和Western Blot均显示重组菌株中已成功表达别藻蓝蛋白单亚基。荧光检测结果显示,在600 nm波长激发下,... 相似文献
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为探索节旋藻藻蓝蛋白的生物合成机理,以钝顶节旋藻(Arthrospira platensisFACHB314)基因组DNA为模板克隆了藻蓝蛋白α亚基基因cpcA、催化脱辅基蛋白与色基结合的裂合酶基因cpcE和cpcF,以及催化色基合成的铁氧蛋白氧化还原酶基因pcyA;以Synechocystissp.PCC6803基因组DNA为模板克隆了亚铁血红素氧化酶基因hox1。然后分别将cpcA、cpcE和cpcF基因构建到质粒pACYCDuet-1中,将hox1和pcyA基因构建到质粒pET-24a(+)中,用电击法将二者共同转化E.coliBL21(DE3),经诱导表达得到具有荧光活性的节旋藻藻蓝蛋白α亚基。在590 nm激发波长下,荧光发射峰为637.8 nm,证实了节旋藻自身的裂合酶CpcE和CpcF能够催化色基PCB与藻蓝蛋白脱辅基结合产生有荧光活性的藻蓝蛋白α亚基,为表达有荧光活性的藻蓝蛋白提供理论和实验基础。 相似文献
3.
藻胆蛋白裂合酶是催化藻胆色素与脱辅基藻胆蛋白亚基共价连接的裂合酶,在藻胆蛋白的生物合成途径中发挥着重要作用。本实验以藻蓝蛋白裂合酶Cpc E/F为研究对象,采用基因工程组合表达技术,构建了pCDFDuet-apcA-cpcE/F-hox1-pebS、pCDFDuet-pecA-cpcE/F-hox1-pebS等重组质粒,并导入大肠杆菌中,在IPTG的诱导下,成功表达得到两种非天然藻胆蛋白ApcA-PEB和PecA-PEB,这表明Cpc E/F不仅可以催化藻蓝胆素和脱辅基藻蓝蛋白的结合,还可以催化藻红胆素(PEB)与别藻蓝蛋白α-亚基(ApcA)和藻红蓝蛋白α-亚基(PecA)的结合,因此是一种多功能的裂合酶。根据重组产物的光谱特征峰分析发现,ApcA-PEB和PecA-PEB作为两种非天然存在的重组藻胆蛋白,具有与对应天然藻胆蛋白有着相近的特征吸收光谱和荧光发射峰,但同时具有明显的波长偏移并伴有色素异化现象,其光谱学性质主要由其所携带的色素基团决定。另外,荧光寿命衰减分析发现,不同脱辅基蛋白对于重组藻胆蛋白的光谱稳定性具有重要的影响。 相似文献
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坛紫菜(Porphyra haitanensis T.J.Chang et B.F.Zheng)中的R-藻蓝蛋白在Bio-Rex 70柱上用脲溶液(pH3.0)解离和层析,得到了α和β两个亚基,用SDS-PAGE测定α和β亚基的分子量分别为18 400和20 500。变藻蓝蛋白的α和β两亚基均分子量经测定,分别为18 800和19 700。R-藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白的分子量分别确定为117 000和112 000,两藻胆蛋白中α和β两个亚基的摩尔比都为1:1,确定两藻胆蛋白的亚基组成都为(αβ)_3。各亚基的发色团含量为:R-藻蓝蛋白中,α亚基含1个藻蓝胆素,β亚基含1个藻蓝胆素和1个藻红胆素。变藻蓝蛋白中,α和β亚基各含1个藻蓝胆素。 相似文献
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利用同源重组质粒pUTK转化蓝藻Synechococcus sp.PCC9742及胸腺素α1的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
采用本实验室构建的丝状蓝藻Wynechococcus sp.PCC7601基因整合平台系统供体系粒pUTK转化单胸藻Syenchococcus sp.PCC7942，通过抗性筛选了具卡那霉素抗性的转化藻株，经Southern杂交证实pHTKUK部分序列已整合到Synechococcus sp.7942染色体DNA上，红光诱导后通过蛋白质SDS－PAGE电泳，Westem blot证实pUTKpUTK的腺素a1基因得以有效表达，表达量达到总蛋白的4．8％，结果表明，基因整合平台系统供全质粒pHT不仅可转化丝状蓝灌Calothrix sp.PCC7601,还可转化单蓝藻Synechococcus sp.PCC7942. 相似文献
6.
为了探究别藻蓝蛋白与类囊体膜光合系统之间的光能传递规律,及其与异源类囊体膜光合系统之间光能转移的可能性,本研究构建了含有钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)的别藻蓝蛋白β亚基基因(apcB),及合成藻蓝胆素的血红素氧化酶基因(ho)和铁氧还蛋白氧化还原酶基因(pcyA)的转化载体pHyg3-apcB-ho-pcyA,利用玻璃珠转化法将其导入莱茵衣藻中。聚合酶链式反应筛选验证阳性转化藻株,Southern Blot结果表明基因apcB、ho、pcyA成功转化入莱茵衣藻基因组中。而后将转化藻株与对照藻株均置于高光(50μmol·m-2·s-1)和低光(25μmol·m-2·s-1)条件、白光和绿光条件中培养,并检测别藻蓝蛋白β亚基的表达、总叶绿素含量、77 K低温荧光、光系统表观电子传递效率、生物量变化。结果显示：实时定量PCR分析和Western Blot检测表明外源基因apcB,pcyA和ho均在转基因藻株Cr-ApcBHP中得到了转录表达。高光和低光条件下光系统Ⅱ(PSⅡ)和光... 相似文献
7.
藻胆蛋白(Phycobiliprotein,PBP)是原核藻类和真核藻类进行光合作用的捕光色素蛋白,占藻体干重的2%左右,主要分为3类:藻红蛋白(phycoer-ythrin,PE)、藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)[1].藻胆蛋白一般由α亚基和β亚基组成,部分藻胆蛋白中还存在γ亚基.一般由α和β亚基形成稳定的单体(αβ),再由单体聚合为多聚体(αβ)n.从蓝藻和红藻中分离的藻胆蛋白为三聚体(αβ)3或六聚体(αβ)6[2]. 相似文献
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藻胆蛋白是某些藻类特有的捕光色素蛋白,其中天然别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白的抗氧化活性已经被证明。实验以2,2-盐酸脒基丙烷(AAPH)为自由基生成者,应用藏红花素退色反应为检测清除氢过氧自由基的方法,探讨了在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达并纯化的带有6×His(6×组氨酸)标签和带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的重组别藻蓝蛋白及其α、β亚基的抗氧化活性。结果表明,带有His标签的6×Hisα-APC、6×Hisβ-APC和6×His-APC均显示出一定的清除氢过氧自由基的能力,其中6×Hisβ-APC清除氢过氧自由基的IC50值可达到27.2 mg/L,Ka/Kc(氢过氧自由基与重组别藻蓝蛋白和藏红花素反应的速度常数比)达到1.24,大于带有色素基团的天然APC清除氢过氧自由基能力(IC5057.5 mg/L);而带有MBP标签的重组别藻蓝蛋白亚基MBPα-APC和MBPβ-APC和MBP-APC(rAPC)则无明显的清除能力。结果首次证实了脱辅基蛋白具有清除氢过氧自由基能力,因而在天然藻胆蛋白中脱辅基蛋白是清除自由基的贡献者之一,这为进一步研究重组别藻蓝蛋白的抗肿瘤机理提供了线索。 相似文献
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采用体外克隆技术获得来自节旋藻6个品系的cpcB基因的257 bp的上游序列和217 bp的编码区序列,并和来自FACHB341的cpcB基因序列对应部分进行比较分析。结果表明,所获得的上游序列和编码区序列都有高度的保守性,而编码区所推导的氨基酸序列的保守性更高。启动子软件预测,在每一上游序列中都存在5条启动子序列,其中,FACHB439的启动子种类和结构与其他品系存在一定的差异。同时,FACHB439的翻译起始区mRNA二级结构与其他品系也有所不同。因此推测,在大多数品系节旋藻中藻蓝蛋白基因存在相同的表达调控机制,而品系FACHB439则可能存在一定程度的差异。 相似文献
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Isochrysis sp.strain HG是一株分离自福建长乐自然海区的金藻,是一种良好的西施舌育苗饵料藻。显微形态观察表明,Isochrysis sp.strain HG的形态特性与等鞭金藻属的球等鞭金藻(I.galbana)和湛江等鞭金藻(I.zhanjiangensis)比较接近。进一步克隆Isochrysis sp.strain HG的核糖体小亚基(small subunit,SSU)18S rRNA基因,获得了长度为1780bp的基因序列。同源性分析表明,该序列与在NCBI数据库中登录的等鞭金藻属的18S rRNA基因序列同源性最高,说明结果与形态鉴定的结果相一致。基于18S rRNA基因序列的系统发育分析表明,Isochrysis sp.strain HG与等鞭金藻属的I.zhangjiangensis、Isochrysis sp.strain CCAP927/14、I.galbana和Isochrysis sp.strain Santou聚在一个分支类群上,其中I.zhangjiangensis与Isochrysis sp.strain CCAP927/14聚为一个独立的子类群,和I.galbana、Isochrysis sp.strain Santou以及目标菌株Isochrysis sp.strain HG形成4个并列独立的分支。根据形态及分子系统分析结果,Isochrysis sp.strain HG可能是不同于I.zhangjiangensis、I.galbana的等鞭金藻种类。 相似文献
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本研究预测naa cluster中的naaB基因负责催化烟酸到6-羟基烟酸的反应。通过对NaaB的蛋白序列进行分析,发现该酶含有三个亚基,分别由naaBL1、naaBS、naaBL2基因编码,其中naaBL1和naaBL2分别编码2个含有钼辅因子结合结构的大亚基,naaBS基因编码一个含有[2Fe-2S]簇的小亚基。本研究对naaB基因进行了克隆,将构建的重组质粒pME6032-naaBL1SL2分别转化到无色杆菌(Achromobacter sp.)和大肠杆菌(Escherichia coli)中,通过HPLC和LC-MS检测验证了NaaB负责催化烟酸到6-羟基烟酸,并且在无色杆菌和大肠杆菌中NaaB均能够转化烟酸,这与之前报道烟酸羟化酶不能在大肠杆菌表达的结果不同,说明NaaB的基因编码和催化功能具有独特性。通过序列分析推测NaaB的这一特性可能跟该酶同时含有两个钼结合结构域的大亚基有关。 相似文献
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《中国海洋大学学报(自然科学版)》2021,51(8)
藻红胆素是一个开链四吡咯结构的发色团,其与脱辅基藻红蛋白结合使藻红蛋白具有光学活性,而血红素加氧酶基因ho对于藻红胆素的合成是至关重要的。本研究对实验室前期已获得的龙须菜中的血红素加氧酶基因ho-1的基因序列进行分析发现,其在藻类中比较保守,存在6个高度保守结构域;结构功能分析显示其具有15个可能的血红素(Heme)结合位点,其中第138位亮氨酸(L)既位于118～145位HemeO的扭结螺旋结构内,又在115～142位的高度保守的结构域内,而且经预测是可能的血红素(Heme)结合位点之一。为了进一步验证该位点的作用,我们拟对其进行定点突变,将第413位碱基由T突变成C,得到ho(M)基因,碱基突变后所对应编码的第138位氨基酸由亮氨酸(L,非极性氨基酸)突变为丝氨酸(S,极性氨基酸)。在此基础上,我们构建了重组质粒pET-ho-1、pET-ho-1-pebS、pET-ho-1-pebA-pebB及pET-ho(M)、pET-ho(M)-pebS、pET-ho(M)-pebA-pebB,将其转化到E.coli BL21中构建重组菌株E.coli ph、E.coli phS、E.coli phAB、E.coli ph(M)、E.coli ph(M)S和E.coli ph(M)AB进行表达,检测重组菌株的荧光发射光谱。结果表明,E.coli phAB和E.coli phS在595 nm处检测到藻红胆素的荧光特征峰,表明ho-1基因编码的血红素加氧酶可以参与催化藻红胆素的合成;E.coli ph(M)、E.coli ph(M)S和E.coli ph(M)AB与E.coli BL21一样无任何特征峰出现,这表明ho(M)中第413位碱基对应编码的第138位亮氨酸是血红素的结合位点,直接影响藻红胆素的合成,该位点的突变使得PebS和PebB/A两条催化途径均无法合成藻红胆素。本研究为阐明血红素加氧酶基因在合成藻红胆素过程中的重要性及龙须菜中藻红蛋白的合成机制,进而进行藻红蛋白的重组表达奠定了基础。 相似文献
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采用亚克隆方法,将别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)基因插入到毕赤酵母整合型表达载体pPIC6αA中,再用SacⅠ线性化,纯化后,用氯化锂法转化毕赤酵母菌株X-33,筛选表达APC的重组子。PCR和序列分析表明,APC基因已整合到酵母染色体中。重组子经甲醇诱导,用Western blotting在培养基上清液检测到APC,表明别藻蓝蛋白(APC)在毕赤酵母中可以表达。APC由两种亚基组成,分子量分别为19kDa和21kDa。重组子经摇瓶培养48h表达量达4.4mg/L。 相似文献
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藻胆体是红、蓝藻特有的光合作用捕光天线复合物。别藻蓝蛋白(APC)是组成藻胆体高效能量传递的核心结构的主要成分。本文以基因重组的别藻蓝蛋白(rAPC)的单体和三聚体为材料,通过稳态光谱、圆二色光谱以及超快时间分辨光谱研究了rAPC的结构构象和能量传递过程。结果表明,rAPC在测试条件下能保持和天然APC一致的光谱特性和活性构象;rAPC单体组装成三聚体后,其α84PCB和β84PCB可以组成激子色素对,通过激子分裂提高三聚体的能量传递效率;超快时间分辨光谱结果显示,在rAPC三聚体中,能量从620 nm传至650 nm的时间为300～600 fs,同时存在着19 fs的激子态的电子退相干过程。这些结果为揭示藻胆体的高效能量传递机制提供了数据基础。 相似文献
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海水螺旋藻C-藻蓝蛋白富硒及其抗氧化特性 总被引：1，自引：0，他引：1
对海水钝顶螺旋藻Spirulina platensis C-藻蓝蛋白的富硒能力及含硒c-藻蓝蛋白对超氧阴离子(O2·)和羟基自由基(·OH)的清除作用进行了研究.结果表明,在添加低浓度硒(40-80mg·L-1)培养时,海水钝顶螺旋藻c.藻蓝蛋白对硒的富集效果显著强于淡水螺旋藻C-藻蓝蛋白.硒浓度为40mg·L-1时,C-藻蓝蛋白对硒的利用率最高,富硒系数最大(O.9%);硒浓度为60mg·L-1时,C-藻蓝蛋白含硒量最高(402mg·kg-1).含硒C-藻蓝蛋白比CJ藻蓝蛋白对超氧阴离子和羟基自由基的清除作用都有所加强,清除效应与C-藻蓝蛋白的含硒量及蛋白浓度呈正相关.C-藻蓝蛋白含硒量最高组(402mg·kg-1)在浓度为180μg·ml-1时,对超氧阴离子和羟基自由基的清除率分别可达到83%和35%,远高于同样条件下其他淡水种类相应蛋白的清除作用.研究结果显示,利用海水培养的螺旋藻能显著提高C-藻蓝蛋白的富硒能力和含硒C-藻蓝蛋白清除超氧阴离子的活性.此研究对开发具有抗氧化功能的含硒C-藻蓝蛋白显示出独特的技术优势和较大的应用潜力. 相似文献
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以杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)为研究对象,通过密度梯度离心方法纯化得到高纯度血蓝蛋白,以其作为抗原皮下注射免疫新西兰大白兔,从而获得高效价的兔源多克隆抗血清。进一步通过Protein A抗原亲和纯化的方法对该抗血清纯化,最终获得效价更高、检测特异性更好的血蓝蛋白多克隆抗体。应用该抗体进行Western检测发现,鲍血淋巴中存在着多样的血蓝蛋白衍生产物;进一步结合质谱技术对其中35 kDa条带进行鉴定发现,其来源于血蓝蛋白I型亚基的H结构域。 相似文献
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采用响应面法对重组大肠杆菌生物合成别藻蓝蛋白(holo-apc A)的发酵条件进行优化,提高了蛋白的表达量。以对重组别藻蓝蛋白α亚基在大肠杆菌中表达量影响较大的几种因素用于中心组合设计;中心组合设计试验结果表明诱导温度、培养基初始p H和诱导时机对诱导结果影响显著;经Design Expert 8.0软件优化后的最佳诱导条件为:诱导温度28℃,培养基初始p H 8.5,IPTG终浓度0.1 mmol/L,以及诱导时机3 h。最后验证试验得到的蛋白表达量在已有文献报道结果的基础上提高了70%~580%。中心组合设计-响应面法能够在有限的实验次数下,对影响生物过程的因子进行优化及对其交互作用进行评价,蛋白表达量达20.4 mg/L;IPTG用量由原来的1 mmol/L减少至现在的0.1 mmol/L,降低了发酵成本。 相似文献
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研究了海洋链霉菌分离株M095的基因转移系统。利用属间接合转移将具有oriT的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pIJ8600转入EscherichiacoliET12567(pUZ8002)中,获得供体菌。将供体菌与预萌发的菌株M095的孢子进行接合转移,将质粒pIJ8600转入菌株M095中,其转化率为1.99×10-4个接合转化子/受体。Southern杂交证明质粒pIJ8600已经整合到菌株M095的染色体上。同时,将来自Spirulinamaxima(Cyanophyta)的别藻蓝蛋白基因(apc)克隆在质粒pIJ8600的XbaI和BglII位点,产生质粒pAPIJ。用接合转移法将质粒pAPIJ转入菌株M095。通过SDS-PAGE分析,得到2个大小为22ku和17ku的蛋白,分别相对应于别藻蓝蛋白的α和β亚基。这些结果进一步证明菌株M095的遗传转化体系已经成功建立起来,这将为其他海洋放线菌遗传转化工作的研究奠定基础。 相似文献
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蓝隐藻藻蓝蛋白结构与功能稳定性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
以蓝隐藻(Chroomonas placiodea)藻蓝蛋白 PC-645为材料,通过改变环境 pH 和尿素质量浓度,监测其变性和复性过程中特征荧光谱和吸收谱的动力学变化,以期了解隐藻藻蓝蛋白的色基和蛋白结构稳定性及其与功能的关系。结果表明, PC-645在很宽的 pH 范围和一定质量浓度的尿素中维持结构和功能的稳定,空间结构具有很强的柔性。pH诱导的 PC-645蛋白构象与功能变化可分为3个不同的区段。(1)稳定区(pH 3.5~7)：吸收和荧光光谱都比较稳定,显示蛋白质构象和功能在此区域都保持正常。(2)次稳定区(pH 7~10)：光吸收依然保持平稳,亚基内部的色基的状态和疏水微环境都没有改变,但荧光传递效率降低,可能是由亚基表面局部构象变化、解离(四级结构变化)或者色素基团间的空间距离变化引起。(3)不稳定区(pH<3.5和 pH>10),吸光度和荧光强度都呈快速下降,色基在近紫外和可见光区的吸收峰位变动,蛋白构象处于快速崩溃期。PC-645在酸性条件下的稳定性高于在碱性环境下,是与隐藻藻蓝蛋白所处的特殊环境及生理功能相适应的。 相似文献