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1.
《中国海洋大学学报(自然科学版)》2016,(7)
针对活性中心突变型胃蛋白酶原难以被激活且稳定性差的问题,本文研究了活性中心突变对胃蛋白酶原激活及其稳定性的影响。根据猪胃蛋白酶原A的基因序列设计引物,通过RT-PCR和重叠延伸PCR法分别获得野生型(rPG)和突变型(D32A和D215A)胃蛋白酶原基因片段,其中突变型胃蛋白酶原分别为活性中心关键氨基酸天冬氨酸(D)突变为丙氨酸(A)。将野生型和突变型胃蛋白酶原分别在酵母中成功表达,研究其激活、激活后的稳定性和活性情况。研究表明,可以成功地在酵母中表达并纯化野生型和突变型重组猪胃蛋白酶原rPG、D32A和D215A。在pH=2.0条件下,rPG在5min内即可全部激活,且在37℃具有良好的稳定性,而D32A和D215A需24h以上才可激活。通过在激活反应中加入野生型胃蛋白酶,D32A和D215A的激活时间可缩短至1h,虽然激活过程有部分酶原发生降解,但激活后获得的突变型胃蛋白酶可稳定3d,激活后的突变型胃蛋白酶无蛋白水解活性。研究结果表明,活性中心关键氨基酸突变后的胃蛋白酶原仍可激活,虽然在激活过程中胃蛋白酶原的稳定性差,但激活后产生的胃蛋白酶稳定性良好,这为进一步研究突变型胃蛋白酶提供了可能和保证。 相似文献
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采用RT-PER原理和长片段扩增技术克隆短沟对虾和斑节对虾酚氧化酶原基因。设计合成特异引物、提取血细胞总RNA，反转录后扩增获得的特异片段回收并克隆到pGEM-TEasyVector系统的T载体上，重组子进行碱基序列测定。结果表明，所克隆的短沟对虾酚氧化酶原基因含起始密码子A1B到终止密码子TGA的2055bp，编码684个氨基酸。斑节对虾酚氧化酶原基因含ATG到TGA的2061bp，编码686个氨基酸。短沟对虾酚氧化酶原推算分子量为78153Da，等电点pI为6．25；斑节对虾则为78581Da，pI为5．83，用DNA分析软件分析显示两种对虾酚氧化酶原基因具有高度的同源性，二者的碱基和推测的氨基酸序列同源性分别为93％和92％；对虾与其他节肢动物酚氧化酶原基因的同源性的高低与种类间亲缘关系相关；不同种类间酚氧化酶活性中心重要组成部分的2个铜结合位点、位于铜结合位点内的6个组氨酸以及与铜结合位点相邻的氨基酸序列高度保守。 相似文献
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采用RT-PCR和RACE技术克隆鲫鱼slc7A8基因的全长cDNA序列,对基因序列用生物软件对基因进行生物信息分析,用Real-time PCR方法检测基因在组织中的mRNA表达丰度。结果表明,鲫鱼slc7A8cDNA全长为2709bp,包含195bp的5′UCR序列,921bp的3′UCR序列,1593bp开放阅读框,编码530个氨基酸序列;鲫鱼与斑马鱼基因同源性和编码氨基酸同源性分别为88.9%和95.5%,而与其他动物分别在70.1%-74.8%和80.6%-82.1%之间;预测编码蛋白的分子量为57719.84,等电点为4.8,对其结构预测显示该蛋白具有与哺乳动物十分相似的12个螺旋跨膜结构,跨膜区氨基酸高度保守,不同动物间的同源性都在92.2%以上;Real-time PCR检测鲫鱼组织中的mRNA表达丰度高低顺序为前肠、中肠、脑、后肠、肌肉、肾、鳃、心、肝脏。 相似文献
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首次从海洋球石藻病毒(Emiliania huxleyi virus-EhV99B1)中克隆了硫氧还蛋白(Trx)基因(该序列已提交GenBank,登录号:GU109280)。系统进化关系分析表明:EhV99B1-Trx与GenBank中已报道的EhV86-Trx(NC_007346)有很高的同源性,核酸及其推导的氨基酸序列的同源性分别为98%和100%,而与其它物种的Trx序列同源性仅为9.8%-18.8%。采用生物信息学方法和工具分析了EhV99B1-Trx的生化参数,预测了该蛋白的高级结构。结果表明:(1)EhV99B1-Trx基因的开放阅读框全长591bp,编码196个氨基酸,蛋白的相对分子量为22.1kDa,理论等电点为5.27;(2)EhV-99B1-Trx N端蛋白结构域具有保守的Cys-Gly-Pro-Cys(CGPC)硫氧还蛋白氧化还原活性位点氨基酸基序;(3)对该蛋白二、三级结构分析预测结果进一步证实EhV99B1-Trx基因编码的为一种新型的硫氧还蛋白家族成员。 相似文献
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采用RT-PCR技术和RACE技术成功克隆淡水鱼类斑鳢sGST基因cDNA全序列,推测得到氨基酸序列,初步分析其结构功能域及系统进化关系。结果表明,斑鳢sGST基因cDNA序列全长为898bp,编码225个氨基酸。斑鳢sGST与真鲷、金头鲷、鲽、黑头鲦、川鲽、大口黑鲈等最新定名为ρ型的sGST氨基酸同源性较高,ρ型sGST为水生生物所特有并共同占据进化树上独立的分枝;与大鼠、小鼠、人等哺乳动物sGST现有所有类型同源性均很低,并且在进化树上距离也较远,表明本研究成功克隆的sGST基因应属于ρ型,可能在鱼类等水生生物对水栖环境的适应上有重要作用。 相似文献
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脊尾白虾酚氧化酶原基因克隆及表达分析 总被引：1，自引：2，他引：1
利用RACE方法获得了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)酚氧化酶原(Prophenoloxidase,proPO)基因。该基因cDNA全长3092bp,开放阅读框2013bp,编码671个氨基酸,其预测分子量为74.82kDa。脊尾白虾酚氧化酶原基因推导的氨基酸序列与其他虾类酚氧化酶原氨基酸序列同源性较高(65%—78%),该氨基酸序列具有铜离子结合位点等酚氧化酶原基因所具有的典型特征位点。组织表达分析结果表明,proPO基因在脊尾白虾血细胞中表达量最高,其次是鳃和肝胰腺组织,在肌肉中几乎不表达。利用荧光定量PCR分析了不同盐度胁迫下脊尾白虾血细胞和鳃组织中的表达变化规律,结果发现在不同盐度胁迫后血淋巴proPO表达量显著高于对照组,盐度胁迫初期鳃组织proPO表达量显著高于对照组。本研究结果表明脊尾白虾酚氧化酶原基因参与了盐度胁迫引起的机体应激反应。 相似文献
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运用PCR、TA克隆及二代测序技术获得了独角雪冰鱼(Chionodraco hamatus)、伯氏肩孔南极鱼(Trematomus bernacchii)的EPO区域基因组DNA序列,并结合生物信息学方法进行了基因结构与保守功能域等生物学特性研究。结果表明:克隆获得的独角雪冰鱼、伯氏肩孔南极鱼EPO基因序列分别为2727 bp和2820 bp,包括5个外显子和4个内含子结构,编码区全长皆为558 bp,推定编码185个氨基酸。理化性质分析得到两者的EPO蛋白皆为相对稳定的酸性可溶性蛋白。其三级结构预测结果都显示出典型的4个反相平行的α螺旋结构特征,保持了其在生物体内发挥的原有作用。多重序列比对显示,独角雪冰鱼EPO与伯氏肩孔南极鱼的氨基酸同源性为95.2%,而与其它物种的同源性在53.9%—85.5%之间。系统发育树显示,独角雪冰鱼、伯氏肩孔南极鱼的EPO基因与鱼类的同源基因聚类,系统进化情况同亲缘关系一致,表明EPO基因在进化过程中具有较强保守性。本研究为揭示EPO基因在南极冰鱼内的遗传特性提供理论依据,并为进一步探讨EPO基因在极端低温高氧环境中的鱼类适应性进化研究奠定了基础。 相似文献
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胶州湾浮游植物分子遗传多样性初步研究 总被引：1，自引：0，他引：1
用聚合酶链式反应扩增海洋浮游植物总体的核酮糖 1 ,5 -二磷酸羧化 /氧化酶大亚基基因(rbc L)片段 ,建立该基因变异类型文库 ,并随机测定了 38个 rbc L大亚基基因片段序列 ,初步分析了海洋浮游植物分子遗传多样性。将≥ 97%的氨基酸序列相似性定义为种内变异 ,38个片段分别代表1 3个不同的物种 ,或称为不同的操作分类单元。与数据库序列比较发现 ,PPJZ0 1 ,PPJZ1 1和 PPJZ2 0可能是已报道的 rbc L基因序列代表的物种 ,其它克隆在数据库中没有对应的近缘物种序列存在。系统学分析表明分离的克隆分别属于隐藻门、硅藻门、绿藻门和 streptophyta等的浮游植物 ,极少数克隆来源于异鞭毛藻类、定鞭藻纲和原细菌。根据各操作分类单元克隆数计算得胶州湾浮游植物分子遗传多样性指数为 1 .97。研究结果为利用分子生物学方法剖分海洋浮游植物群落结构、研究海洋浮游植物动力学积累了基础数据 相似文献
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β-胡萝卜素酮化酶(BKT)是雨生红球藻虾青素合成途径中的关键酶。根据GenBank中所收录的雨生红球藻BKT的cDNA序列设计特异性引物,以高光照处理的雨生红球藻细胞的总RNA为模板,采用RT-PCR的方法克隆出了β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)。序列测定结果表明,bkt全长960bp编码320个氨基酸。克隆的bkt序列与GenBank收录的BKT的cDNA(AY603347)序列只相差一个碱基。并对其编码的氨基酸进行了二级结构的预测和疏水性分析。同时将所克隆的bkt构建入衣藻叶绿体表达载体p64Dbkt,为基因的进一步表达研究及探索其作用机制奠定了基础。 相似文献
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鳕鱼(Gadous macrocephaius)皮水解蛋白亚铁修饰对大鼠营养性贫血改善的实验研究 总被引：1，自引：0，他引：1
以鳕鱼皮为原料,采用双酶水解法制备鱼蛋白水解物再经亚铁修饰获得鱼蛋白水解物亚铁复合物(Fe-FPH),并对Fe-FPH进行了抗营养性贫血的实验研究。结果表明:(1)以水解度(DH)为5%的鱼蛋白水解物为原料,在pH7.0、温度20℃、螯合时间15min的条件下可获得Fe-FPH6.7%;(2)Fe-FPH蛋白含量为85.1%,铁含量达40254mg/kg,氨基酸价为59.62;(3)抗营养性动物实验研究表明:Fe-FPH给药组第5天可显著提高营养性贫血大鼠的Hb含量,第11天时表现出极显著效果;Fe-FPH组,第11天有显著降低大鼠血中PPIX作用,到第18天时表现出极显著效果。因此,Fe-FPH不仅含有较高的营养价值,而且有显著抗营养性贫血功能,可望成为鳕鱼加工副产物高效利用的有效途径。 相似文献
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采用黄芪多糖、葡聚糖作为免疫佐剂,与迟缓爱德华氏菌灭活疫苗配伍后注射免疫大菱鲆,测定免疫28d后血清中溶菌酶活力、SOD活力、抗体效价和各免疫组的相对保护率(RPS)。结果表明,添加多糖免疫佐剂能提高疫苗免疫的大菱鲆的各免疫指标,添加佐剂的免疫组的血清溶菌酶活力、SOD活力和血清效价比单纯的疫苗免疫组显著提高(P<0.05),2.5mg/ml黄芪多糖混合疫苗免疫组和5mg/ml葡聚糖混合疫苗免疫组的相对保护率最高,分别达(78.7±1.3)%和(64.0±8.9)%,且溶菌酶活力、SOD活力及血清效价等指标较其他各组有提高。 相似文献
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采用干法授精方法获得受精卵,在人工培育条件下观察了光唇鱼胚胎及仔、稚鱼发育过程。结果表明,光唇鱼受精卵呈圆球形,沉性、弱粘性。在水温23—25℃下,胚胎发育历时46h45min,经历了胚盘形成、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官形成和孵化等阶段。在水温24—27℃下,仔、稚鱼发育历时22d,初孵仔鱼具有较大的卵黄囊,胸鳍原基及肛门原基形成;4日龄仔鱼开口摄食,进入混合营养期;7日龄仔鱼卵黄囊消失,营外源性营养,体侧8条横斑形成,各鳍均已出现,进入晚期仔鱼阶段;14日龄仔鱼各鳍鳍条发育基本完成;16日龄仔鱼鳞片开始出现,进入稚鱼期;22日龄稚鱼全身被鳞,进入幼鱼期。 相似文献
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温度、pH和氮、磷含量对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)生长的影响 总被引：3，自引：0，他引：3
以南太湖水华蓝藻铜绿微囊藻为材料,研究了温度、pH和氮、磷浓度对铜绿微囊藻生长的影响,为阐述微囊藻水华形成的机制提供科学依据。研究结果表明,铜绿微囊藻对温度的适应范围较广,15—40℃温度范围内铜绿微囊藻均可生长,25—30℃为铜绿微囊藻的最适生长温度,当温度达到45℃时,铜绿微囊藻停止生长并逐渐死亡。在pH6.5—9.5范围内,铜绿微囊藻均有较高的生长量,最适pH为8.0—9.0,pH值高于9.0时,铜绿微囊藻的最终生长量略有下降。BG-11培养基中添加高浓度的氮(1g/LNH4Cl)后,铜绿微囊藻的生长被显著抑制(P0.01),但同时添加不同浓度的磷(0.36—10mg/LKH2PO4)后,显著地提高了铜绿微囊藻的生长(P0.01),不同磷浓度处理之间无极显著差异,氮磷平衡是影响铜绿微囊藻生长的重要因素。 相似文献
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大竹蛏(Solen grandis)cDNA文库中微卫星标记的筛选 总被引：1，自引：1，他引：0
利用微卫星查找软件SSRIT对大竹蛏cDNA文库(2038条EST)中2—6个碱基重复单元组成的简单序列重复进行了筛选。最少重复次数设定为5次,共发现包含微卫星位点的EST96条,占整个EST数据库的4.71%;共发现微卫星位点103个,其中含双碱基重复序列77个,数量最多,占总数的74.76%;三、四碱基重复序列分别占微卫星序列总数的22.33%、2.91%,没有发现五或六碱基的重复。对含有SSR位点符合微卫星引物设计的EST序列,利用在线引物设计软件Primer3设计合成引物14对,以南通野生群体为模板PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳发现,其中5对有多态性位点。在5个微卫星位点上,等位基因的数目从2—7个不等,观测杂合度和期望杂合度分别为0.067—1.000和0.066—0.775,香农指数在0.146—1.545之间。结果表明,所筛选的微卫星标记可用于遗传分析。 相似文献