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1.
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国的大型经济鱼类,其养殖发展迅速。有关半滑舌鳎的基因组文库构建和分析等方面的研究,目前尚未见报道。用流式细胞仪检测雌性半滑舌鳎基因组大小。从半滑舌鳎雌鱼肌肉提取基因组DNA,选取大小合适的DNA片段,经末端修复并回收后,再以Fosmid作为载体,构建半滑舌鳎雌鱼基因组文库。经检测,雌性半滑舌鳎基因组大小约为606.36 Mb。所构建的Fosmid文库含有49 920个克隆,重组率为96.88%;插入片段长度分布在33~45 kb之间,平均为39.2 kb;覆盖雌性半滑舌鳎基因组3.12倍;从文库中筛选得到单拷贝DNA序列的概率为95.6%。对培养第1天和第6天的克隆进行比较,结果表明文库稳定性高,培养过程中没有发生变化。 相似文献
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利用改良的SDS法提取钝顶螺旋藻基因组DNA，经Sau3AI酶切，回收1～2kb大小的片段，与BamHI（Sau3AI的同尾酶）酶切并去磷酸化后的pBR322质粒载体相连接，转入大肠杆菌（Escherichia coli）Top10细胞，构建了螺旋藻基因组质粒文库。根据pBR322载体上多克隆位点两侧序列设计锚定引物，根据丝状蓝藻丝氨酸／苏氨酸激酶（STK）保守序列设计简并引物，以螺旋藻质粒文库为模板，“巢式”扩增出了STK基因部分序列。螺旋藻基因组质粒文库的构建为功能基因研究提供了极大方便。 相似文献
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带鱼(Trichiurus haumela)鱼卵DNA的提取及其18S rDNA初步分析 总被引：2，自引：0，他引：2
目前应用显微镜技术很难进行鱼卵种类的准确鉴定,本文尝试采用DNA技术开展鱼卵的鉴定工作。以带鱼(Trichiurus haumela)鱼卵为研究对象,采用苯酚-氯仿法提取了其DNA基因组,并采用PCR及克隆测序的方法,对其18S rDNA序列进行了测定与初步分析。结果表明,提取的带鱼(T.haumela)鱼卵DNA基因组片段长度约23kb,PCR扩增片段长度约1.8kb;带鱼(T.haumela)鱼卵18S rDNA与其它已知鱼类的18S rDNA序列具有一定的差异性,可以用其进行带鱼(T.haumela)鱼卵的初步鉴定。 相似文献
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三角褐指藻磷酸甘油酸变位酶基因可能侧翼序列的筛选、克隆以及序列测定 总被引：2，自引：2，他引：2
采用RT PCR的方法从酵母中成功地得到了磷酸甘油酸变位酶的cDNA基因 ,分别用32 P和地高辛 ddUTP标记以用作探针。以32 P标记的探针筛选三角褐指藻基因组文库 ,获得了 4kb的阳性DNA片段 ;进一步分析发现 ,该 4kb片段的真正阳性区域是位于片段端部的30 6bp的序列 ,因此认为该序列为三角褐指藻磷酸甘油酸变位酶基因的侧翼部分。克隆该30 6bp的DNA片段 ,并且测定其序列。结果表明 ,该 30 6bp的DNA片段包含两个同向重复序列 ,每个重复序列的大小为 1 1 6bp ,在每个重复序列中均含有GGTTCAATGT区域 ,这与一般常见的真核基因 5′端的CAATbox有相似之处。 相似文献
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中国对虾微卫星DNA的筛选 总被引：35，自引：5，他引：35
于2000年2月以中国科学院海洋研究所水族楼暂养的中国虾对材料，采用常规方法从尾部肌肉中提取DNA，构建小片段部分基因组文章，采用人工设计合成的（CT）7，（AT）7重复征段作引物，利用RCR法对中国对虾小片段部分基因组文库进行筛,一实验首冼 对中国对虾中获得31个微卫星序列，分别分析于18个阳性重组克隆中，其中perfect共23个，占74％，imperfect2个，占7％，compound perfect1个，占3％，compound imperfect5个，占16％，结果还表明，在中国对虾基因组DNA中，（CT）n,(AT)n)形式的微卫星序列的含量非常丰富。 相似文献
7.
本研究旨在从DNA分子水平上研究中国鲎(Tachypleus tridentatus)种群遗传多样性及种群结构等相关信息,以期为保护其野生群体种质资源提供科学依据。本研究通过生物素—磁珠富集法筛选微卫星标记,构建中国鲎基因组微卫星文库。基因组DNA经Fast Digest Tru1I酶切后,选取400 bp~1000 bp片段,用生物素标记的(GT)15、(CT)15混合探针与其杂交,杂交复合物与链霉亲和素磁珠结合,捕获含有重复序列的微卫星片段,纯化后连接PMD19-T载体克隆,构建基因组微卫星文库。从334个阳性克隆中随机选取196个片段大于400 bp的阳性克隆进行测序,共获得127个微卫星序列,其中完美型占69.3%、非完美型占11.0%、复合型占19.7%。除探针使用的GT和CT的重复序列外,还筛选到多碱基GCT、TGG、AAAC、ACAA、GATTT、TTTTA的重复序列。根据微卫星序列设计选择合成40对引物,结果显示其中3对具有较高多态性,可作为进一步评价中国鲎野生种质资源等遗传信息的有效遗传标记。 相似文献
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栉孔扇贝Fosmid文库的构建及基因组结构特征分析 总被引：2，自引：0，他引：2
研究构建第一个栉孔扇贝的fosmid基因组文库,该文库包含133 851个克隆,插入片断平均长度为40 kb,覆盖栉孔扇贝基因组的4.3倍.栉孔扇贝DNA在fosmid传代中表现得较为稳定,没有发现插入片段的丢失或重排.所有的克隆进行了超级池和二级池的构建,并筛选了2个基因和7个微卫星,结果阳性克隆数介于2到8之间.由此可见,该文库可以很好的用于目的基因或标记的筛选,将有利于物理作图和基因的图位克隆研究.2 016个克隆进行双末端测序,获得3 646 条序列.序列总长2 286 986 bp,大约占栉孔扇贝基因组的1.84‰.共得到2 500条串连重复序列,其中微卫星序列371条,小卫星序列1 816条,卫星序列313条.共得到317条散布重复序列,总长97 412 bp,占测序总长的4.26%.查找到的散布重复序列共有4种类型:DNA 转座子、LTR 反转座子、LINE反转座子和滚环转座子,其中LINE反转座子的数目最多.BLAST比对共有1 383条序列与数据库现有的序列有明显的相似性(E＜e-5),占测序总数的37.93%.BLASTN比对有明显相似性的1 036条序列中,与nr数据库序列相似的有113条,与EST数据库序列相似的有923条.BLASTX比对有明显相似性的序列有347条,占序列总数的9.52%. 相似文献
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用RNA提取试剂--TRIZOL Reagent提取刺参(Apostichopus japonicus)肌肉组织总RNA,用SMART cDNA Library Construction Kit构建cDNA文库.经测定原始文库滴度达到 3.2×10~6,扩增后文库滴度达到 5.1×10~9,重组率达到96.7%,从扩增文库随机挑取12 个克隆进行PCR 扩增鉴定,结果显示,插入片段大小为0.5～2.5 kb.通过各项指标验证成功构建了刺参肌肉组织cDNA 文库. 相似文献
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龙须菜四分孢子体cDNA文库的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究不同世代和性别基因表达谱的差异 ,本文构建了龙须菜 (Gracilarialemaneiformis)四分孢子体的 c DNA文库。总 RNA提取使用 RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen) ,c DNA文库构建使用 SMART c DNA Library Construction Kit(Clontech) ,包装蛋白购自 Promega公司。该c DNA文库含有 1 .2 8× 1 0 6个克隆 ,扩增文库的滴度是 1 .98× 1 0 9pfu/ m L,重组频率是 85.0 % ,插入片段几乎全部集中在 50 0～ 1 50 0 bp之间 相似文献
11.
采用磁珠富集法,利用生物素标记的(GT)15寡核苷酸探针从三疣梭子蟹基因组DNA的Sau3A1酶切的500-1000bp片段中筛选微卫星序列.洗脱的杂交片段克隆到PMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出阳性克隆进行测序.在56条测序序列中有49条非冗余序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点,阳性序列比例达到87.5%.其中perfect类型微卫星最大的重复次数为47次.在47条非冗余序列中,共有40条(85.1%)微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计.本研究中筛选的微卫星位点将为下一步的三疣梭子蟹种群遗传结构分析、经济性状的QTL定位提供遗传标记. 相似文献
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九龙江口红树植物分子分类的初步研究 总被引：5，自引：0，他引：5
本研究工作以福建九龙江口龙海红树林自然保护区浮宫种苗园内7种红树植物为材料，采用改进的CTAB法获得了纯度较高(A260/A280在1.6～2.0之间)，得率高(DNA平均得率约为120×10－6m/m，FreshWeight)，片段完整(片段大小约为23kb左右)的基因组DNA，并运用RAPD技术对这7种红树植物进行了遗传多样性分析．从30个10-mer随机引物中筛选出9个有效引物，并利用这9个有效引物共扩增出352条DNA带.利用UPGMA法对红树植物的7个种间的亲缘关系进行聚类分析，得出7个种的DNA分子分类系统图,并与传统的分类进行比较,发现结果相符，从而确定了RAPD技术用于红树植物分子分类研究的可行性，并为从分子水平研究红树植物遗传多样性,保护、开发和利用红树林资源提供科学依据. 相似文献
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通过对半滑舌鳎雌鱼fosmid文库进行有序混合,成功构建了两步-三维PCR筛选体系,为后续的基因筛选奠定了基础。通过对半滑舌鳎W染色体文库序列进行引物设计,并分别在雌、雄鱼基因组DNA中筛选,获得1对雌鱼特异性引物。使用该引物对fosmid文库进行筛选,得到1个雌鱼特异性克隆,并通过荧光原位杂交技术将克隆定位到了W性染色体上,证实了使用该体系进行文库筛选的有效性以及雌鱼引物的特异性,建立了半滑舌鳎遗传性别的分子及细胞遗传学鉴定方法,为后续半滑舌鳎基因组及性染色体的研究奠定了基础。 相似文献
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单环刺螠线粒体基因组全序列的获得——长PCR 结合鸟枪法测序 总被引：1，自引：0，他引：1
由于具有单基因所不可比拟的优势,线粒体基因组现已成为后生动物种群遗传和分子系统发育研究中一个重要的信息来源。本研究选取螠虫动物的代表物种——单环刺螠(Urechis unicinctus),详细阐述了利用长PCR方法扩增其线粒体DNA,获得约15 kb的扩增产物,进而构建shotgun文库,最终成功获得单环刺螠线粒体基因组全序列的流程。本实验流程样品需求量少、设备要求低、简便快捷。 相似文献
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为构建南极冰藻Chlamydomonassp.ICE-L的cDNA文库,提取对数生长期南极冰藻ICE-L的总RNA,以此为模板,通过PowerScript逆转录酶逆转录合成第一链cDNA;再以第一链cDNA产物为模板,用LD-PCR合成第二链cDNA。该cDNA产物经分级分离转入大肠杆菌中,即获得南极冰藻ICE-L的cDNA原始文库,其滴度为1.6×106cfu/mL。扩增后的cDNA文库的滴度为1.0×1010cfu/mL。用PCR方法测得文库的重组率大于97%,插入cDNA的长度为0.5~1.8 kb,0.9 kb以上插入片段占50%以上。取适量扩增文库稀释并铺平板,挑取72个独立菌落,对其中22个独立菌落所插入的cDNA进行测序,克隆到了一个具有5′和3′非编码区的40S ribosomalprotein S5全长基因序列,GenBank收录号为AM167929。 相似文献
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深海环境通常具有高盐,高压,高/低温,无光照等特点,使得海洋微生物存在一套独特的生理代谢机制和分子细胞结构,然而迄今绝大部分深海微生物不能在实验室条件下被分离培养,深海微生物资源开发遇到很大挑战。本研究通过不依赖培养的方法研究海洋微生物的基因资源,构建了南海深海沉积物fosmid宏基因组文库,共获得约39 600个克隆,插入片段范围在24~45 kb之间,平均插入片段大小为33 kb,克隆片段的总库容达到1 320 Mb。通过功能筛选获得3个具有淀粉酶活性的克隆子,选取其中最适温度较低的amy7作为进一步研究对象。构建amy7插入片段的重组质粒文库,获得一个同样有淀粉酶活性的克隆子amy7-6。经测序,克隆子amy7-6含有3 291 bp插入片段,序列比对分析后发现其中一个大小为1 920 bp的ORF,其编码的蛋白质序列(AmyS)与各种来源的糖苷酶有着较高的相似性。 相似文献
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对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus,WSSV）是危害对虾养殖业的主要病原,而WSSV极早期基因对病毒功能基因的转录翻译和调控起着至关重要的作用.本研究将WSSV基因组以超声法随机断裂至400～900bp DNA片段,并插入启动子缺失且多克隆位点下游具有报告基因的载体来构建文库,转染昆虫细胞Hi5.倒置荧光显微镜观察发现部分转染后的细胞有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达,表明这部分细胞中的DNA片段可能具有极早期启动子活性.流式细胞仪分析显示,这部分荧光细胞占总细胞的比例为0.35%.由于转染效率为50%,可认为占比0.7%的WSSV基因组随机片段能在Hi5细胞中激发下游报告基因的转录翻译,可能具有极早期基因启动子活性.这对于进一步筛选和鉴定WSSV极早期基因及开展极早期启动子研究具有重要的意义. 相似文献
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采用磁珠富集法,利用生物素标记的(GT)15寡核苷酸探针从泥蚶基因组DNASau3A1酶切的500—1000bp片段中筛选GT/CA微卫星位点。洗脱的杂交片段克隆到PMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出阳性克隆进行测序。在139条序列中有115条序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点,阳性序列比例达到82.7%。其中perfect类型微卫星最大的重复次数为35次。在112条非冗余序列中,共有100条(88.5%)微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计。 相似文献
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坛紫菜微卫星DNA序列的筛选 总被引：4，自引：0，他引：4
自坛紫菜(Porphyrahaitanensis)丝状体中提取的DNA,经Sau3AI限制性内切酶消化后,将300~900bp之间的DNA片段回收,并连接到经BamHI酶切并去磷酸化的pUC18载体上,最后转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,构建坛紫菜小片段DNA质粒文库。选用pUC18质粒的通用引物进行PCR反应,对文库进一步筛选并检测插入片段的大小,在384个阳性克隆中,有278个含有大小合适的插入片段。经测序及序列分析,在103个克隆中获得172个微卫星序列,其中完美型107个,占62.2%,非完美型53个,占30.8%。(GC)n与(CG)n在坛紫菜DNA中非常丰富,分别占25%及17%,但重复频率相对较低。 相似文献