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1.
利用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了宽体沙鳅(Botia reevesae)-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为1795bp,由长100bp的5非翻译区(untranslated region,UTR)、570bp的3非翻译区和1125bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成,编码375个氨基酸。宽体沙鳅-actin氨基酸序列包含1个糖基化位点、9个N-豆寇酰化位点、3个actin信号位点等主要结构区域。PSI-BLAST比对表明,宽体沙鳅-actin氨基酸与真鲷、罗非鱼、虹鳟等鱼类同源性达99%。NJ法系统进化分析显示宽体沙鳅-actin首先与鲢聚在一起,然后与、尖头等鱼类聚在一起。荧光定量PCR检测-actin基因在宽体沙鳅脑、鳃、心脏、肝、胃等12个组织的表达无显著差异(P<0.05),具有良好的稳定性。 相似文献
2.
热休克蛋白70(HSP70)是生物体内一种重要的机体与细胞保护性蛋白。本文利用RT-PCR以及RACE技术首次克隆获得太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)HSP70简称Ep.HSP70 c DNA的全长序列,序列全长为2252bp(KY807149),开放阅读框(ORF)长1947bp,编码649个氨基酸,5′端99bp,3’端206bp;预测蛋白分子量为70.81k Da,等电点为5.16,为一种亲水性蛋白,不存在信号肽及跨膜区,含有丰富的α螺旋结构(37.60%),β折叠(18.80%)。同源氨基酸序列比对发现,与其他甲壳动物的同源基因保守性较高,尤其是HSP70家族典型的结构位点序列在甲壳类动物中具有高度保守性。系统进化分析表明,太平洋真宽水蚤和安氏伪镖水蚤(Pseudodiaptomus annandalei)进化关系最近;桡足类种内同源性要高于虾蟹类,与虾类同源性高于蟹类。荧光定量数据分析表明,不同浓度铜、镉、锌胁迫下太平洋真宽水蚤HSP70基因表达水平具有显著的时间效应与浓度效应的特征,三种金属对Ep.HSP70抑制效应呈现CuCdZn的趋势。Ep.HSP70基因的成功克隆及金属胁迫下的表达分析为深入研究HSP70蛋白生物学功能具有重要意义。 相似文献
3.
采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了浙江枝吻纽虫热休克蛋白70(DzHSP70)基因全长cDNA序列,并利用荧光定量PCR方法,分析了该基因在重金属胁迫下的表达特征。结果表明,DzHSP70cDNA全长2827bp,包括294bp的5’UTR、628bp的3’UTR和编码634个氨基酸残基的1905bp的开放阅读框。HSP70家族的3个签名序列以及细胞质特异性调控基序EEVD等特征元件在DzHSP70中高度保守。重金属离子Fe3+、Pb2+和Cd2+均可上调该基因的表达,其中Pb2+的毒理效应最强。研究结果表明DzHSP70可能参与了机体对于重金属的解毒过程。 相似文献
4.
克隆获得缢蛏(Sinonovacula constricta)谷胱甘肽S-转移酶(Sc-GSTσ)和热休克蛋白90(Sc-HSP90)基因的cDNA全长，分析了它们的组织表达差异及其在氨氮胁迫下的表达特征。结果表明，Sc-GSTσ的全长cDNA为1 414 bp，含有639 bp的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，编码212个氨基酸，Sc-GSTσ氨基酸序列与其他物种的GST氨基酸序列同源性为31.88%～43.40%；而Sc-HSP90的全长cDNA为2 752 bp，ORF为2 181 bp，编码726个氨基酸，其氨基酸序列与其他物种HSP90的氨基酸序列同源性为76.77%～87.05%。荧光定量PCR分析发现，Sc-GSTσ和Sc-HSP90在缢蛏各组织中均有表达，两者均在肝胰腺中表达量最高。氨氮胁迫后，Sc-GSTσ和Sc-HSP90 mRNA在肝胰腺中表达均显著上调(p<0.05)，表明氨氮胁迫引起机体的应激反应，2个基因可能参与机体解毒或防御过程。但胁迫后期表达量下降推测是机体的防御能力有限，不足以完全保护宿主免受应激诱导的细胞损伤。 相似文献
5.
企鹅珍珠贝热休克蛋白70基因的克隆与序列比较分析 总被引：3，自引：0，他引：3
采用同源克隆和锚定PCR技术,从企鹅珍珠贝Pteria penguin中克隆到热休克蛋白hsp70基因的cDNA全序列.cDNA全长2 308 bp,3'非编码区域(UTR)为234 bp,5'UTR为118 bp,开放阅读框(ORF)为1 956 bp,编码651个氨基酸,分子量为70.97 kd,理论等电点为5.24,有2个糖基化位点:NKSI和NVSA,并含有HSP70家族的3个签名序列:IDLGTTYS,DLGGGTFD和IVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端的保守序列EEVD.结合BLAST分析的结果,可以确认获得的cDNA序列为企鹅珍珠贝HSP70的编码序列.与合浦珠母贝Pinctada fucata hsp70的氨基酸序列相比,企鹅珍珠贝多1个糖基化位点NVSA,少1个氨基酸,包括1个氨基酸插入和2个缺失.两者的氨基酸序列一致性高达92%,突变位点52个;两者的核苷酸序列一致性高达79%,突变位点416个.系统发育分析表明两者的亲缘关系最近,与传统分类相符,然后与太平洋牡蛎等聚合在一起.该基因的克隆和比较分析为进一步深入研究珍珠贝类的抗逆机理、抗性育种及其进化具有重要意义. 相似文献
6.
热休克蛋白(heat shock proteins:HSPs)为动植物响应外界胁迫产生的一类蛋白质,能有效改善机体对外界胁迫的适应能力。本研究基于先前获得的低盐胁迫金乌贼(Sepia esculenta)高通量转录组数据,对与低盐胁迫密切相关的热休克蛋白(热休克蛋白家族和晶体蛋白(crystallin)家族)基因进行挖掘;鉴于实时定量内参基因筛选,同时挖掘出金乌贼肌动蛋白(actin)家族系列基因;然后,对肌动蛋白、热休克蛋白和晶体蛋白家族基因及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析并探究低盐胁迫对金乌贼热休克蛋白和晶体蛋白家族基因表达的影响。金乌贼肌动蛋白家族基因包括actin、内收肌actin、胞质actin、actin 1、actin II和βactin 6个成员,热休克蛋白家族基因包括HSPβ、小HSP、HSP 10、HSP 16、HSP 30、HSP 60、HSP 70、HSP 75、HSP 90α、HSP 90和HSP 90β11个成员,金乌贼晶体蛋白家族基因包括S crystallin、S crystallin 6、S crystallin SL18和O crystallin 4个成员。氨基酸序列比对发现,肌动蛋白家族6个基因共享甘氨酸、精氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和天冬氨酸等13个位点,晶体蛋白家族4个基因共享苯丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸、酪氨酸、丝氨酸和半胱氨酸等17个位点,而热休克蛋白家族HSPβ、小HSP、HSP 10、HSP 16和HSP 305个基因共享1个甘氨酸位点和4个保守位点,HSP 60、HSP 70、HSP 75、HSP 90α、HSP 90和HSP 90β6个基因仅共享2个保守位点。实时定量结果发现,低盐胁迫可以明显提高金乌贼HSPβ、HSP 16、HSP 30和HSP 70的基因表达,而明显降低晶体蛋白家族基因的表达,表明在低盐胁迫条件下,金乌贼热休克蛋白家族基因通过自身的差异表达来提高机体对外界胁迫的适应防御能力。 相似文献
7.
盐藻胞浆hsp70 cDNA的克隆及其mRNA的诱导表达 总被引：2，自引：0，他引：2
用cDNA末端快速扩增方法克隆得到了一个2652bp的盐藻(Dunaliella salina)胞浆hsp70 cDNA全长，编码着650个氨基酸残基的多肽。推导的氨基酸序列有2个ATP酶结合位点和一个多肽结合区。由克隆得到的盐藻cDNA推导的氨基酸序列，经GenBank blast后与数据库中胞浆hsp70序列一致。与莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、人、小麦(Triticum astivum)和啤酒酵母(Saccharamyces．cerevisiae)胞浆hsp70的序列一致性分剂为83％、80％、81．5％和80．5％。Northern印迹显示，90min后，mRNA量在40℃热休克时是光诱导时的3倍。光诱导则使hsp70 mRNA积累相对迟缓。结果表明，所克隆得到的hsp70基因蛋白产物定位在盐藻细胞浆中，光诱导和热休克均可以使hsp70 mRNA水平明显增高，但以热休克为显著。 相似文献
8.
采用同源克隆和RACE-PCR(Rap id amp lification of DNA ends-PCR)技术,从黄鳍鲷Acanthopgrus latus中克隆了白细胞介素1β(interleuk in-1,βIL-1β)基因的全长cDNA序列。黄鳍鲷IL-1β的cDNA全长共1 242 bp,5端非编码区(UTR)为121 bp,3端非编码区(UTR)为342 bp,开放阅读框(open read ing fram e,ORF)为762 bp,编码一条253个氨基酸残基的多肽,分子量约为28.5kDa,理论等电点为5.55,含有2个潜在的糖基化位点。同源性分析表明与其它鱼类和脊椎动物的IL-1β序列具有较高的同源性。利用软件S ignalP分析表明它不存在信号肽序列,氨基酸序列中不存在IL-1β转换酶(interleuk in-1βconverting enzym e,ICE)剪切位点,推导可能成熟肽为从第85位氨基酸开始共169个氨基酸残基的多肽,分子量约为18.9kDa。将此成熟肽序列克隆入pQE30质粒构建表达载体pQE30-IL1β,并在大肠杆菌Escherichia coliM15(pREP4)中进行诱导表达,获得了分子量约为21 kDa的特异性融合蛋白。 相似文献
9.
根据已测序的克隆号PCI246基因序列设计2条引物,用快速扩增cDNA末端技术扩增克氏原螯虾(Procambarus clarkii)70 ku热休克蛋白同类物基因cDNA的5'端片段和3'端片段,测序得到1 184 bp基因片段,包含该基因的完整3'端,GenBank登录号AY357302,与GenBank序列号AB016836家蚕(Bombyx mori)的70 ku热休克蛋白同类物mRNA的部分片段83%同源。和果蝇(Drosophila melanogaster)的热休克蛋白同类物3的同源性最高(GenBank的登录号分别是NP_727 563,NP_511 132,NP_727 564,NP_727 565),为85%。 相似文献
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VASA蛋白属于DEAD-box家族蛋白,是一种RNA解旋酶,在生殖细胞的分化中具有重要作用。本研究从脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢中克隆得到vasa基因cDNA全长(将其命名为Ec-vasa),Ec-vasa序列长度为2516bp,开放阅读框(ORF)长度为1800bp,编码600个氨基酸,具有DEAD-box家族蛋白的8个高度保守的结构域,与日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的同源性最高(80%)。半定量RT-PCR结果显示,Ec-vasa在卵巢组织中特异表达,在肌肉、肝胰腺、心脏和鳃等组织中均未检测到表达。荧光定量结果显示,Ec-vasa在卵巢发育Ⅰ期具有较高表达量,随着卵巢的发育,表达量逐渐降低,在第Ⅳ期达到最低水平。结果表明,Ec-vasa基因可能在脊尾白虾卵巢的早期分化和卵子发生过程中起重要作用。 相似文献
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黄斑篮子鱼去毒相关基因的克隆与肝脏组成型表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
从基因水平探讨海洋鱼类对海洋藻毒素的去毒分子机理。采用RT-PCR法成功克隆了黄斑篮子鱼Siganus oramin肝脏I时相代谢酶细胞色素P450 1A(CYP1A)、II时相代谢酶alpha型谷胱甘肽S-转移酶(GSTA)和rho型谷胱甘肽S-转移酶(GSTR)、热休克蛋白70 (HSP70)、alpha 1型钠钾ATP酶(ATP1A1)及β-肌动蛋白(beta-actin, ACT)基因cDNA核心序列，序列分别长879 bp、582 bp、588 bp、660 bp、749 bp和554 bp。序列同源性分析发现，属鲈形目的黄斑篮子鱼CYP1A、GSTA和GSTR与同属鲈形目的牙鲆Paralichthys olivaceus、欧洲鲽Pleuronectes platessa、真鲷Pagrus major、鲤形目的斑马鱼Brachydanio rerio 相应氨基酸序列同源性较高，CYP1A和GSTA与非洲爪蟾(两栖类)、鸡(鸟类)、小鼠、大鼠和人(哺乳类)相应氨基酸序列同源性低，这可能与鱼类I、II时相去毒酶基因承担水环境毒素去毒代谢的特殊功能有关；而HSP70、ATP1A和β-肌动蛋白在鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类中均有较高的同源性，这可能与这些基因在机体中承担的最基本的生命功能相关。应用半定量RT-PCR的方法，以β-肌动蛋白作为外参照，在指数期增长范围内分别得到了CYP1A、GSTA、GSTR、HSP70和ATP1A1 mRNA与β-肌动蛋白mRNA (%)的比值，确定黄斑篮子鱼肝脏去毒相关基因的组成型表达水平。其中，黄斑篮子鱼肝脏CYP1A、GSTA和GSTR基因组成型表达相对较高，HSP70和ATP1A1基因组成型表达相对较低，这可能与不同基因在黄斑篮子鱼海洋藻毒素去毒分子机理中承担的作用相关，为海洋藻毒素在海洋鱼类中的积聚及代谢去毒分子机制的研究提供了相关数据。 相似文献
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泥蚶(Tegillarca granosa)血红蛋白基因(Tg-HbIIA)克隆、分析及免疫表达研究 总被引：1，自引：0，他引：1
通过已构建的泥蚶血液cDNA文库,克隆得到泥蚶Tg-HbIIA基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学、组织表达及免疫相关分析。结果表明,泥蚶Tg-HbIIA cDNA全长731bp,包含63bp5′非编码区(5′-UTR),246bp3′非编码区(3′-UTR),开放阅读框450bp,编码150个氨基酸;其氨基酸序列与毛蚶(Scapharca kagoshimensis)和不等壳毛蚶(Scapharca inaequivalvis)的序列有较高的同源性,分别达到89%和88%;对其结构预测显示该蛋白具有血红蛋白功能域,含有10个潜在血红素结合位点。qRT-PCR检测结果显示:泥蚶不同组织部位中,Tg-HbIIA mRNA在血液表达量最大,其次为外套膜和鳃,表达量最低的是肝胰脏;在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticu)、脂多糖、肽聚糖刺激后,泥蚶血液Tg-HbIIA mRNA表达量显著上调,表明Tg-HbIIA在贝类抗菌免疫防御中可能起重要作用,而Tg-HbIIA对不同致病因子免疫反应的灵敏度和表达时序存在一定差异。 相似文献
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采用常规急性实验方法,研究了不同干露胁迫条件对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)成活率的影响。结果表明,保持虾体湿润并用冰块降温的P组干露胁迫12h后成活率为75%,显著高于其它各实验组(P<0.05)。采用实时荧光定量PCR方法研究了不同干露胁迫条件对脊尾白虾血细胞和肝胰腺组织中热休克蛋白70(HSP70)和ferritin基因表达的影响。干露胁迫能诱导脊尾白虾血细胞、肝胰腺HSP70基因的表达上调,肝胰腺中的高表达时间相对血细胞中出现的较早;干露胁迫能诱导湿润低温P组脊尾白虾血细胞和肝胰腺ferritin基因的表达上调,并显著高于对照组(P<0.05),而且各组织ferritin基因表达的上调时间具有差异性,血细胞最先上调。其余实验组脊尾白虾各组织ferritin基因表达均下调,并显著低于对照组(P<0.05)。上述结果表明,在脊尾白虾受干露胁迫的耐受范围内,HSP70和ferritin基因发挥抗氧化功能。 相似文献
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脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)ferritin 基因克隆及表达分析 总被引：1，自引：1，他引：0
采用RT-PCR及RACE技术获得了总长度为755bp的脊尾白虾ferritin基因cDNA序列。该基因序列5’和3’的非编码区分别为112bp和146bp,开放阅读框497bp,推测编码169个氨基酸,预测蛋白分子量19.1kDa,等电点5.46,该基因命名为Ecfer基因。利用Neighbor-joining法构建系统进化树分析结果表明,Ecfer基因氨基酸序列与无脊椎动物中的甲壳动物聚为一支(同源性为64%—67%)。此外,Ecfer基因氨基酸序列与脊椎动物铁蛋白H链同源性为53%—57%。采用荧光定量RT-PCR研究Ecfer基因在组织中以及经WSSV刺激后血淋巴、肝胰腺中的表达变化情况。研究结果表明,Ecfer在肝胰腺、卵巢、肌肉、鳃和血淋巴中均有分布。注射WSSV后3h和6h,肝胰腺和血淋巴Ecfer基因表达较对照组均显著上调(P<0.05),并具有显著的时间差异性。说明Ecfer基因可能参与了脊尾白虾抵抗WSSV入侵的免疫反应。 相似文献
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团头鲂(Megalobrama amblycephala)两种热休克蛋白 70(HSP70s)的原核表达、纯化及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
采用PCR方法扩增团头鲂组成型HSC70和诱导型HSP70基因完整的编码区片段,并分别克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),用1mmol/L IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达。采用Ni-NTA His Bind Resins亲和层析和DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析对目的蛋白进行纯化,并进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果表明,成功构建了团头鲂两种重组表达质粒pET-22b(+)/Ma-HSC70和pET-22b(+)/Ma-HSP70,表达融合蛋白的相对分子量均约为72kDa,并能与兔抗人HSP70多抗进行特异性结合,这两种HSP70s融合蛋白经纯化后的纯度均达到95%以上。本实验选择融合蛋白Ma-HSC70在25℃和Ma-HSP70在30℃下分别诱导7h作为可溶性表达的最佳条件。 相似文献
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