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为深入分析热休克蛋白响应胁迫的分子机制,实验以宽体沙鳅(Botia reevesae)为研究对象,利用同源克隆和cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE) 技术克隆得到宽体沙鳅热休克蛋白70(BR-HSP70) 的cDNA 全长。结果发现,BR-SP70 cDNA全长为2,371bp,包含1,947 bp的开放阅读框(opening reading frame,ORF),102 bp 5’-非编码区(untranslated region,UTR)和322 bp 3’-UTR等。通过序列同源性比对发现,BR-HSP70 cDNA与团头鲂(Megalobrama amblycephala)和猪(Sus scrofa)的同源性分别为98%及83%,且ORF编码的649个氨基酸中含有HSP70家族的家族信号标签、N-糖基化位点及EEVD等能位点等保守序列。上述结果表明,本研究所获的基因为宽体沙鳅 HSP70基因。实时荧光定量PCR 分析发现,氨氮胁迫和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)侵染均会显著上调宽体沙鳅鳃、肝脏及肾脏HSP70 mRNA的表达,表明HSP70基因在宽体沙鳅应对环境胁迫中发挥了重要的抗应激作用。 相似文献
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热休克蛋白90(HSP90)作为一种研究的常规免疫基因,在许多物种都有过报道。本研究从构建的魁蚶转录组文库中筛选得到的HSP90基因部分序列为基础,通过RACE技术获得其c DNA全长序列(命名为Sb HSP90),以期明确魁蚶HSP90基因的结构特征、组织分布及其对病原菌刺激的免疫变化规律。序列和结构分析表明,该c DNA全长2707bp,编码一个由728个氨基酸组成的多肽,该多肽含有HSP90家族共有的5个签名序列,C端高度保守的MEEVD短肽序列和ATPase结构域;预测蛋白的分子量(Mw)为83.72k Da,理论等电点(p I)为4.85;预测该蛋白无信号肽,具有4个糖基化位点。同源性及系统分析表明,Sb HSP90基因与软体动物的HSP90相似性达到83%以上,其中与长牡蛎(Crassostrea gigas)和海湾扇贝(Argopecten irradians)相似度最高达86%,与甲壳动物HSP90的相似度都在81%左右,与脊椎动物HSP90-α和HSP90-β的同源性都很接近。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)结果表明:Sb HSP90 m RNA在魁蚶血细胞、斧足、鳃、外套膜、闭壳肌和肝胰腺和中均有表达,斧足中的表达量相对较高,而在肝胰腺中的表达量则相对较低;注射鳗弧菌后,相对于对照组,Sb HSP90基因在所检测的每个组织中m RNA水平上的表达量都显著上调(P0.01),而且具有显著的时间依赖性和瞬时表达趋势。 相似文献
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热休克蛋白70(HSP70)是生物体内一种重要的机体与细胞保护性蛋白。本文利用RT-PCR以及RACE技术首次克隆获得太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)HSP70简称Ep.HSP70 c DNA的全长序列,序列全长为2252bp(KY807149),开放阅读框(ORF)长1947bp,编码649个氨基酸,5′端99bp,3’端206bp;预测蛋白分子量为70.81k Da,等电点为5.16,为一种亲水性蛋白,不存在信号肽及跨膜区,含有丰富的α螺旋结构(37.60%),β折叠(18.80%)。同源氨基酸序列比对发现,与其他甲壳动物的同源基因保守性较高,尤其是HSP70家族典型的结构位点序列在甲壳类动物中具有高度保守性。系统进化分析表明,太平洋真宽水蚤和安氏伪镖水蚤(Pseudodiaptomus annandalei)进化关系最近;桡足类种内同源性要高于虾蟹类,与虾类同源性高于蟹类。荧光定量数据分析表明,不同浓度铜、镉、锌胁迫下太平洋真宽水蚤HSP70基因表达水平具有显著的时间效应与浓度效应的特征,三种金属对Ep.HSP70抑制效应呈现CuCdZn的趋势。Ep.HSP70基因的成功克隆及金属胁迫下的表达分析为深入研究HSP70蛋白生物学功能具有重要意义。 相似文献
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热刺激对栉孔扇贝免疫功能和热休克蛋白表达的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国海洋大学学报(自然科学版)》2017,(8)
为探究热刺激对栉孔扇贝(Chlamysfarreri)免疫功能的影响,以及热休克蛋白在应对急性高温胁迫时的作用。本研究对一龄栉孔扇贝进行28℃热刺激,采用流式细胞术于0、1、2、4、8h测定血细胞的吞噬率和活性氧ROS含量;以鳗弧菌和溶壁微球菌为底物测定血清抗菌、溶菌活力;用彗星实验测定DNA损伤;用AO/EB(吖啶橙/溴化乙啶)荧光染色法检测细胞凋亡;用荧光实时定量PCR检测HSP70和HSP90mRNA相对表达量。研究表明:热刺激使血细胞中活性氧含量、吞噬活性以及血淋巴抗菌、溶菌活力受到抑制,总体表现为下降趋势;DNA损伤和细胞凋亡受热刺激诱导显著上升,具有明显的时间-效应关系;HSP70、HSP90mRNA表达量显著上调,反应迅速,且HSP70受热刺激诱导更显著。研究结果表明,热刺激导致栉孔扇贝血细胞发生细胞凋亡、加剧DNA损伤,造成免疫力下降,而机体通过大量表达热休克蛋白HSP70、HSP90保护细胞和组织免受损伤。本研究为探究夏季易发扇贝大规模死亡原因提供了理论依据。 相似文献
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AGO蛋白(Argonature protein)作为RNA诱导沉默复合物的核心元件,在植物的非生物胁迫过程中发挥着重要作用。以前期获得的盐地碱蓬转录组数据为基础,开展了针对盐地碱蓬(Suaeda salsa)AGO蛋白的生物信息学及盐胁迫下的表达规律研究。采用RACE技术克隆2个AGO基因家族成员(SsAGO1、SsAGO16)的cDNA全长序列,并对其蛋白结构、进化关系、表达模式等进行分析。结果表明:盐地碱蓬2类AGO蛋白家族成员基因长度分别为3 212 bp和3 766 bp,编码的蛋白均是一个无跨膜结构域、无信号肽的亲水性蛋白,α-螺旋散布于每个蛋白质的整体结构中;SsAGO1和SsAGO16都含有一个未知的结构域DUF1785,除此之外,SsAGO1还含有PAZ和PIWI两个特征结构域,而SsAGO16仅含有PIWI结构域,SsAGO1和SsAGO16亲缘关系较远,且具有不同的时空表达模式。首次从盐地碱蓬鉴定了AGO蛋白基因并进行了盐胁迫下的表达规律分析,为研究AGO蛋白家族在盐生植物耐盐生理过程中的作用奠定了基础。 相似文献
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黄斑篮子鱼去毒相关基因的克隆与肝脏组成型表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
从基因水平探讨海洋鱼类对海洋藻毒素的去毒分子机理。采用RT-PCR法成功克隆了黄斑篮子鱼Siganus oramin肝脏I时相代谢酶细胞色素P450 1A(CYP1A)、II时相代谢酶alpha型谷胱甘肽S-转移酶(GSTA)和rho型谷胱甘肽S-转移酶(GSTR)、热休克蛋白70 (HSP70)、alpha 1型钠钾ATP酶(ATP1A1)及β-肌动蛋白(beta-actin, ACT)基因cDNA核心序列，序列分别长879 bp、582 bp、588 bp、660 bp、749 bp和554 bp。序列同源性分析发现，属鲈形目的黄斑篮子鱼CYP1A、GSTA和GSTR与同属鲈形目的牙鲆Paralichthys olivaceus、欧洲鲽Pleuronectes platessa、真鲷Pagrus major、鲤形目的斑马鱼Brachydanio rerio 相应氨基酸序列同源性较高，CYP1A和GSTA与非洲爪蟾(两栖类)、鸡(鸟类)、小鼠、大鼠和人(哺乳类)相应氨基酸序列同源性低，这可能与鱼类I、II时相去毒酶基因承担水环境毒素去毒代谢的特殊功能有关；而HSP70、ATP1A和β-肌动蛋白在鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类中均有较高的同源性，这可能与这些基因在机体中承担的最基本的生命功能相关。应用半定量RT-PCR的方法，以β-肌动蛋白作为外参照，在指数期增长范围内分别得到了CYP1A、GSTA、GSTR、HSP70和ATP1A1 mRNA与β-肌动蛋白mRNA (%)的比值，确定黄斑篮子鱼肝脏去毒相关基因的组成型表达水平。其中，黄斑篮子鱼肝脏CYP1A、GSTA和GSTR基因组成型表达相对较高，HSP70和ATP1A1基因组成型表达相对较低，这可能与不同基因在黄斑篮子鱼海洋藻毒素去毒分子机理中承担的作用相关，为海洋藻毒素在海洋鱼类中的积聚及代谢去毒分子机制的研究提供了相关数据。 相似文献
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企鹅珍珠贝热休克蛋白70基因的克隆与序列比较分析 总被引：3，自引：0，他引：3
采用同源克隆和锚定PCR技术,从企鹅珍珠贝Pteria penguin中克隆到热休克蛋白hsp70基因的cDNA全序列.cDNA全长2 308 bp,3'非编码区域(UTR)为234 bp,5'UTR为118 bp,开放阅读框(ORF)为1 956 bp,编码651个氨基酸,分子量为70.97 kd,理论等电点为5.24,有2个糖基化位点:NKSI和NVSA,并含有HSP70家族的3个签名序列:IDLGTTYS,DLGGGTFD和IVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端的保守序列EEVD.结合BLAST分析的结果,可以确认获得的cDNA序列为企鹅珍珠贝HSP70的编码序列.与合浦珠母贝Pinctada fucata hsp70的氨基酸序列相比,企鹅珍珠贝多1个糖基化位点NVSA,少1个氨基酸,包括1个氨基酸插入和2个缺失.两者的氨基酸序列一致性高达92%,突变位点52个;两者的核苷酸序列一致性高达79%,突变位点416个.系统发育分析表明两者的亲缘关系最近,与传统分类相符,然后与太平洋牡蛎等聚合在一起.该基因的克隆和比较分析为进一步深入研究珍珠贝类的抗逆机理、抗性育种及其进化具有重要意义. 相似文献
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盐藻胞浆hsp70 cDNA的克隆及其mRNA的诱导表达 总被引：2，自引：0，他引：2
用cDNA末端快速扩增方法克隆得到了一个2652bp的盐藻(Dunaliella salina)胞浆hsp70 cDNA全长，编码着650个氨基酸残基的多肽。推导的氨基酸序列有2个ATP酶结合位点和一个多肽结合区。由克隆得到的盐藻cDNA推导的氨基酸序列，经GenBank blast后与数据库中胞浆hsp70序列一致。与莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、人、小麦(Triticum astivum)和啤酒酵母(Saccharamyces．cerevisiae)胞浆hsp70的序列一致性分剂为83％、80％、81．5％和80．5％。Northern印迹显示，90min后，mRNA量在40℃热休克时是光诱导时的3倍。光诱导则使hsp70 mRNA积累相对迟缓。结果表明，所克隆得到的hsp70基因蛋白产物定位在盐藻细胞浆中，光诱导和热休克均可以使hsp70 mRNA水平明显增高，但以热休克为显著。 相似文献
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壬基酚（Nonylphenol,NP）是一种典型的环境内分泌干扰物，具有高亲脂性、难降解性、生物蓄积性和高毒性，其广泛应用引起的环境污染问题越发严重。本研究选取长牡蛎（Crassostrea gigas）为研究对象，关注壬基酚暴露后长牡蛎免疫相关基因的转录表达变化，以探索壬基酚暴露对海洋贝类免疫系统的影响。实验结果表明：长牡蛎的抗氧化酶（SOD、CAT和GPX）、热休克蛋白（Heat shock proteins,HSP）以及NF-κB蛋白家族有关基因在壬基酚刺激后的表达显著提高。实验初步证明了壬基酚刺激可显著影响长牡蛎免疫相关基因的表达，为以后结合病原刺激实验解析贝类大规模死亡原因打下基础；另一方面，也可为明晰海洋贝类壬基酚胁迫响应机制提供参考。 相似文献
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克隆获得缢蛏(Sinonovacula constricta)谷胱甘肽S-转移酶(Sc-GSTσ)和热休克蛋白90(Sc-HSP90)基因的cDNA全长，分析了它们的组织表达差异及其在氨氮胁迫下的表达特征。结果表明，Sc-GSTσ的全长cDNA为1 414 bp，含有639 bp的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，编码212个氨基酸，Sc-GSTσ氨基酸序列与其他物种的GST氨基酸序列同源性为31.88%～43.40%；而Sc-HSP90的全长cDNA为2 752 bp，ORF为2 181 bp，编码726个氨基酸，其氨基酸序列与其他物种HSP90的氨基酸序列同源性为76.77%～87.05%。荧光定量PCR分析发现，Sc-GSTσ和Sc-HSP90在缢蛏各组织中均有表达，两者均在肝胰腺中表达量最高。氨氮胁迫后，Sc-GSTσ和Sc-HSP90 mRNA在肝胰腺中表达均显著上调(p<0.05)，表明氨氮胁迫引起机体的应激反应，2个基因可能参与机体解毒或防御过程。但胁迫后期表达量下降推测是机体的防御能力有限，不足以完全保护宿主免受应激诱导的细胞损伤。 相似文献
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为选育高成活率的大菱鲆(Scophthalmus maximus)抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)群体,对30个大菱鲆选育二代家系(F2)和1个普通养殖群体进行鳗弧菌攻毒实验(周期为14 d),统计分析死亡率。选取死亡率不同的6个选育家系和普通养殖群体构成7个实验组,采用半定量-聚合酶链反应(semi-quantitative polymerase Chain reaction,RT-PCR)技术对它们肝脏、脾脏、头肾的相关免疫因子——溶菌酶(Lysozyme)、抗菌肽(Hepcidin)、热激蛋白70(HSP70)、热激蛋白90(HSP90)、免疫球蛋白(Ig M)、C-型凝集素(C-type lectin)、Lily-型凝集素(Lily-type lectin)的表达量开展研究,并应用SPSS 16.0软件对攻毒前后各免疫因子的表达量与攻毒后存活率之间的相关性进行分析。研究结果表明:攻毒前后选育家系幼鱼肝脏、脾脏、头肾中7个免疫因子的表达量普遍高于普通养殖幼鱼,且在7个实验组中,攻毒后的表达量相较攻毒前均呈现下降趋势;攻毒前,肝脏中lysozyme、Ig M的表达量与存活率为极显著性正相关(P0.01),HSP70、HSP90、C-type lectin、Lily-type lectin的表达量与存活率为显著性正相关(P0.05);脾脏中,Hepcidin、HSP70和HSP90的表达量与存活率为极显著性正相关(P0.01);头肾中,HSP70的表达量与存活率为显著正相关(P0.05)。综上,可以推断选育家系相对于普通养殖群体大菱鲆抗鳗弧菌性能更强,且7种免疫因子在鳗弧菌感染鱼体的过程中发挥重要的抗感染作用;从F2中获得一个抗鳗弧菌性能较强的家系(23号),可用于今后大菱鲆抗鳗弧菌品系的选育指导工作,为大菱鲆高成活率群体的选育提供参考资料和理论依据。 相似文献
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盐度是影响三疣梭子蟹人工繁育非常重要的一个环境因素，抗低盐品系的三疣梭子蟹受到水产养殖界的广泛喜爱。分子标记辅助育种可以大大加快良种选育和性状改良的的过程，目前作为第三代的分子标记技术的SNP，广泛应用到三疣梭子蟹耐低盐品系选育过程中。本实验室已有的研究中，通过不同群体分别在盐度11和33下的基因表达差异，构建的比较转录组学数据中总共包含了615条与低渗调节相关的基因片段。为了发掘三疣梭子蟹与低盐适应相关SNP，本研究基于三疣梭子蟹比较转录组学数据研究结果，筛选出低盐调节相关候选基因片段50条，设计引物进行PCR扩增，共得到总长为18511 bp的DNA片段。通过直接测序法在低盐相关片段上发现了85个SNP位点，分布频率为0.46/100 bp，其中转换突变的比例为81%，颠换突变的比例为19%，转换的比例远远大于颠换，符合“transition bias”原理。C/T或G/A突变所占比例为55%；G/T或C/A比例为26%，A/T突变所占比例为12%，G/C突变比例为7%。通过飞行质谱法，在三疣梭子蟹低盐适应性状分离群体中各成功分型了23个SNP位点。通过卡方检验分析发现，8个SNPs与低盐适应显著相关（P<0.05）。其中有三个关联性SNP位点位于表皮蛋白基因上，有三个SNP位点位于三个新基因上，其他两个SNP位点分别位于水通道蛋白和氯离子通道蛋白基因上。这些标记的开发为三疣梭子蟹耐低盐新品种选育方法的建立奠定了良好的基础。 相似文献
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本研究克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)胞内氯离子通道蛋白基因,命名为Pt CLIC。该基因c DNA全长2000bp,5’和3’非编码区(UTR)长分别为76bp和1162bp,开放阅读框长762bp,推测编码253个氨基酸,预测分子量为29.2k Da,理论等电点为5.93。生物信息学分析表明,Pt CLIC基因中未发现跨膜结构域,属于不稳定蛋白;同源性分析表明,Pt CLIC基因编码的氨基酸序列与蚤状溞(Daphnia pulex)CLIC基因的同源性高达83%;系统进化分析表明,三疣梭子蟹与拟穴青蟹首先聚为一支;实时荧光定量RT-PCR分析表明,Pt CLIC基因在选取的所有组织中均有表达,在肝胰腺中的相对表达量最高,且显著高于其它组织(P0.05)。低盐度胁迫显著改变了Pt CLIC基因在三疣梭子蟹鳃和肝胰腺中的表达模式,整体呈先上调后下调的趋势,并发现该基因在低盐耐受和低盐敏感家系中的表达规律差异显著。研究结果表明Pt CLIC基因在三疣梭子蟹渗透压调节中发挥重要作用,可辅助三疣梭子蟹耐低盐品系的选育。 相似文献
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大黄鱼(Pseudosciaena crocea)热激蛋白的基因克隆、原核表达及抗血清的制备 总被引：1，自引：1，他引：1
应用trizol裂解法提取象山港网箱养殖大黄鱼肝脏总RNA,采用RTPCR获得大黄鱼cDNA;通过设计特异引物进行PCR扩增,将PCR产物转化到质粒并直接测序,得到1.7kb的目的基因;同时将此目的基因连接到表达质粒pSBET中,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达以及表达产物的分析。克隆基因的表达产物经SDSPAGE分析表明,HSP基因的蛋白分子量为60kDa左右,与阅读框的编码大小一致;表达蛋白经纯化后免疫小鼠制备抗血清。Westernblotting检测结果表明,制备的抗血清与HSP蛋白起较强的特异性反应。HSP基因的系统进化分析表明,大黄鱼与非洲爪蟾最为接近,从侧面印证了脊椎动物中两栖纲动物与鱼纲动物的亲源关系。通过大黄鱼HSP基因的提取和分析,可为以后制备出核酸探针、筛选和克隆出一批具有优良性状的基因、构建基因文库等研究工作奠定基础。 相似文献
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促肾上腺皮质激素释放激素结合蛋白(CRH-BP)是一种糖基化蛋白,与促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)具有很高的亲和力,对CRH诱导的脑垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)的释放起到抑制作用。本研究采用RT-PCR与RACE基因克隆方法首次获得太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)CRH-BP基因全长cDNA序列(GenBank登录号:MF289345)1950bp,其中ORF区1245bp编码415个氨基酸,5′非编码区841bp,3′非编码区294bp,理论分子量/等电点为45.816/5.87。生物学序列分析结果表明,太平洋真宽水蚤CRH-BP氨基酸序列与桡足类中近亲真宽水蚤同源性最高;具有6个蛋白修饰位点及蛋白家族标签序列,具有明显的跨膜结构域及信号肽。实时荧光定量PCR分析结果表明,太平洋真宽水蚤CRH-BP基因在盐度、温度及pH环境胁迫中的mRNA表达量均具有一定的时间梯度表达性与浓度梯度表达性特征。本文通过对太平洋真宽水蚤CRH-BP基因结构及不同环境因子刺激下的表达特点的研究为探究桡足类在环境应激、生殖生理及免疫调控等方面奠定了理论基础。 相似文献