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1.
高产壳聚糖酶菌株的筛选和发酵产酶条件研究 总被引：12，自引：1，他引：12
为探讨专一性地降解甲壳质或壳聚糖的甲壳质酶或壳聚糖酶 ,从采集的土样中分离到 4株产壳聚糖酶能力较强的菌株 ,经摇瓶复筛 ,菌株YJ0 2产酶能力最强。对其发酵产酶条件的研究结果表明其产酶最适培养基组分为 (% ,w/v) :粉末壳聚糖 2 .0 ,葡萄糖 0 .1,NH4NO3 1.0 ,酵母提取物 0 .5 ,K2 HPO40 .0 7,KH2 PO40 .0 3 ,NaCl0 .5 ,MgSO4·7H2 O 0 .0 5 ,起始 pH 6.0。最适产酶培养条件是 :5 0 0mL三角烧瓶装瓶量为 15 0mL ,2 .0 % (v/v)接种量 ,3 0℃ ,15 0r/min培养 72h。在最适产酶培养条件下 ,72h时菌株YJ0 2发酵液中壳聚糖酶活力可达到 17.0 4U/mL。 相似文献
2.
《海洋与湖沼》编辑部 《海洋科学》2012,36(7):128-129
Bohaisea-9145海洋耶氏酵母碱性脂肪酶基因的克隆、异源表达和重组酶酶学性质采用基因重组和分子生物学相关技术,对海洋耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Bohaisea-9145海洋低温碱性脂肪酶(Y.lipolytica Bohaisea-9145,LipYp)基因lipYp(1116bp)克隆,并在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行了异源真核表达研究。结果表明,阳性重组子经摇瓶发酵54 h后 相似文献
3.
褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)是一种海藻酸降解菌.本实验采用PCR的方法,以褐球固氮菌基因组DNA为模板,克隆出约1.05 kb的海藻酸裂解酶基因algL的成熟蛋白编码序列,并将其插入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K-algL.重组质粒线性化后用聚乙二醇(PEG)法导入毕赤酵母菌株GS115中,获得高效分泌表达海藻酸裂解酶的毕赤酵母工程菌株.用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,表达得到43 kDa的目的蛋白,酶活力可达1 400 U/cm3左右.经测定,该重组酶的最适反应pH为8.5,最适反应温度为40℃,并且在20~55℃,pH2.0~11.0具有较好的稳定性.另外,10 mmol/cm3的Cu2+,Fe2+,Co2+,Mn2+和Ca2+对酶有不同程度的抑制作用. 相似文献
4.
壳聚糖酶的分离纯化及性质研究 总被引：4，自引：0，他引：4
以本实验室分离的产壳聚糖酶YJ02菌株出发,制备壳聚糖酶发酵液,经离心、(NH4)2SO4分级盐析、Q-SepharoseFast Flow阴离子交换、Sephacry S-100凝胶过滤分离纯化步骤,SDS-PAGE显示为一条带,壳聚糖酶纯化了28.9倍,收率为47.6%。该酶的性质研究表明,该酶的分子量为66.2KD,最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0;Mn2 对酶活力有明显的促进作用,Cu2 ,Fe3 ,Hg2 对酶活力有抑制作用;小分子有机物EDTA和SDS对酶活力有抑制作用,而IAA和β-巯基乙醇对酶活力稍有促进作用。该壳聚糖酶对高脱乙酰度壳聚糖底物水解作用强,酶解位点可能为NGlc-NGlc,酶最大反应速度Vmax=4.1μmol/min,常数Km为64mmol/L。此壳聚糖酶水解壳聚糖制备的壳寡糖数均分子量为2 400Da。 相似文献
5.
将已有的低温脂肪酶基因克隆至表达载体pPICZα上,并转化毕赤酵母X-33。在低温条件下诱导培养6d后,发酵液中可检测到低温脂肪酶活力。重组酵母发酵液加入二硫苏糖醇后单位酶活力达到32U/mL,与未加入该试剂的原始菌株相比提高4倍以上。对重组脂肪酶的酶学性质研究表明,其最适pH为8.0,最适温度为35℃,50℃温浴30min后,仍有30.04%的活性。以不同碳链长度的4-Nitrophenyl Ester为底物检测其底物特异性,结果显示其较适合作用于短链底物。重组酵母能够在BMMY培养基中胞外分泌表达带有His标签的重组脂肪酶,经镍柱纯化后,SDS-PAGE检测可得到大约35kDa的单一蛋白质条带。 相似文献
6.
从土壤中筛选得到一株产壳聚糖酶菌株P003,对其进行了发酵条件优化.结果表明其最适发酵培养条件为:(NH4)2SO42.0%,粉末壳聚糖1.0%,葡萄糖0.1%,K2HPO40.07%,KH2PO40.03%,NaCl 0.5%,MgSO4·7H2O 0.05%,酵母提取物0.3%,调pH至5.0;2.0%接种量,500 mL三角瓶装液量为150 mL,32℃下150 r/min摇床培养96 h,在此条件下菌株发酵液的壳聚糖酶活力达108 u/mL.采用硫酸铵分级盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析等方法,从菌株的发酵液中分离出了分子质量为30.5 ku的壳聚糖酶. 相似文献
7.
以海洋交替单胞菌(Alteromonas sp. Y-389)的基因组为模板,设计普鲁兰酶基因的引物并进行PCR扩增。将目的基因连接到载体pET-28a(+)后进行测序并进行生物信息学分析。结果显示,基因的开放阅读框全长4 347 bp,编码1 449个氨基酸的普鲁兰酶,为Ⅰ型普鲁兰酶,有4个保守的结构域,属于糖苷水解酶家族13;将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),成功诱导出了可溶性的目标蛋白;随后对其酶学性质进行测定与分析,结果表明,该酶的比活力为54.53 U/mg,其最适的反应温度为35℃,最适pH为6.0,Na~+和Mn~(2+)对该酶的活性具有明显的促进作用,而Cu~(2+),Zn~(2+)与Fe~(2+)对其活性的抑制作用比较明显;其酶学参数K_m和V_(max)分别为3.12 mg/mL,228.8 U/mg,将为今后的规模化生产提供数据支持。 相似文献
8.
根据酵母整合质粒的设计要求,PCR扩增2.2 kb rDNA片段,导入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)整合载体pYD1中,设计并合成适合在酵母中表达的鲑鱼降钙素(Salmon Calcitonin),以此为目标基因,构建适合酿酒酵母多拷贝整合的表达载体p-r-sCT.通过载体p-r-sCT引入到酿酒酵母菌株EBY100中,得到酵母重组菌株yAGA2-r-sCT.流式细胞检测结果表明,目标基因鲑鱼降钙素在重组菌株的yAGA2-r-sCT中得到了表达,实现了外源基因在酿酒酵母菌株中的稳定表达. 相似文献
9.
烟曲霉产壳聚糖酶液体发酵条件研究 总被引：6，自引：0，他引：6
以烟曲霉(Aspergillus fumigatus)为出发菌,通过选择适合的培养条件,筛选出产壳聚糖酶的菌株。实验结果表明,烟曲霉是良好的产壳聚糖酶出发菌。烟曲霉液体发酵产壳聚糖酶最适培养基组成为:壳聚糖1%,KH2PO40.06%,尿素0.2%,(NH4)2SO40.1%,MgSO40.012%,20%土豆汁3%,NaCl 0.05%。在pH 5.0、温度28℃、摇床转速120 r/min培养条件下振荡培养3 d,烟曲霉产壳聚糖酶的能力最强,达25.1 U/mL。 相似文献
10.
从实验室保存的pBS-Trx重组质粒中克隆球石藻病毒EhV-Trx基因,构建毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-EhV-Trx,将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,诱导分泌表达并对重组蛋白进行二硫键还原酶活性分析。结果表明,EhV-Trx基因开放阅读框为591bp,编码197个氨基酸;在毕赤酵母GS115中成功诱导表达重组EhV-Trx,经SDS-PAGE分析目的蛋白分子量约为27.8kDa;重组EhV-Trx具有二硫键还原酶的活性,能有效打开胰岛素A、B两条链的二硫键,有望开发成一种新型的硫氧还蛋白脱敏制剂应用于食品安全领域。 相似文献
11.
将青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)肌球蛋白重链基因片段亚克隆到pET-30a质粒,构建出重组表达载体并转化入大肠杆菌Escherichia coli BL21中.经SDS-PAGE和Western杂交检测表明,在IPTG诱导下含有重组载体的菌株可表达分子质量约30 ku的融合蛋白.诱导条件优化实验结果显示,该菌株经0.2 mmol/L IPTG诱导1 h就可大量表达此蛋白.可溶性实验确认该重组蛋白是可溶性蛋白.本研究为文昌鱼肌球蛋白重链特异性抗体的制备奠定了基础. 相似文献
12.
建立螺旋藻转基因体系初报 总被引：9，自引：1，他引：8
Mao Yunxiang 《中国海洋大学学报(自然科学版)》2000,30(Z1):13-18
从钝顶螺旋藻单细胞克隆的制备、重组平台的 克隆、同源重组表达质粒的构建、质粒的电激转化和报告基因的表达等方面对螺旋藻转基因 表达系统进行了研究,初步建立起螺旋藻转基因体系。用次氯酸钠溶液处理获得无菌培养系 ;用钠、钙离子混合液处理,获得了可再生的螺旋藻单细胞。用含EDTA的培养基预培养和用 培养基洗涤可分别去除胞外核酸酶活性和抑制胞内核酸酶活性。以氯霉素乙酰转移酶基因替 换大肠杆菌表达质粒pBV220的抗性选择标记,同时插入系列同源重组片段和萤火虫荧光素酶 基因,构建了同源重组表达载体pBVCS01-04L。电激转化螺旋藻S6-4品系单 细胞,获得了具有稳定氯霉素抗性的培养系,并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实了报告基 因的表达。 相似文献
13.
采用PCR扩增、构建重组高效表达载体的方法,进行了牙鲆多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的克隆、原核表达研究,并利用SDS-PAGE、western-blot及ELISA方法对纯化的重组蛋白特性进行了分析。结果表明,PCR扩增出pIgR开放阅读框(ORF)基因全长为1005 bp,所构建的pET-32(a)-pIgR重组质粒经PCR和双酶切鉴定含有ORF全长基因。SDS-PAGE结果表明,表达的目的蛋白相对分子质量为58 kDa,与理论预期值一致,IPTG诱导6h后表达量趋于稳定,经亲和层析纯化得到高纯度的重组蛋白。Western-blot结果表明,重组pIgR能够与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应;ELISA结果表明重组pIgR能够与牙鲆IgM发生特异性结合。本研究获得了纯化的重组pIgR,证明其具有IgM结合活性,为下一步研究牙鲆pIgR的转运机制及在黏膜免疫防御中的作用机理提供了分子基础。 相似文献
14.
海洋聚磷菌中核苷二磷酸激酶基因的克隆及序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
以海洋聚磷菌Halomonas YSR-3的总DNA为模板，用PCR法扩增核苷二磷酸激酶基因，将扩增片段克隆到pGM．T载体，转化Escherichia coli TOP10菌株，经蓝白斑筛选、菌落PCR得到阳性克隆，测序后对序列进行Blast比对分析。得到的基因序列长度为420bp，翻译后的序列与Loktanella vestfoldensis SKA53，Jannaschia sp．CCS1，Roseobacter sp．CCS2的核苷二磷酸激酶蛋白序列相似性分别为89％，86％，85％。 相似文献
15.
利用SYBR荧光定量PCR技术，制备用于花鲈（Lateolabrax japonicus）PPARα基因实时荧光定量PCR检测的质粒标准品．通过PCR扩增出目的片断344-bp，纯化后连接至pMDI8-T载体，转化宿主菌E．coli DH5α．通过PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析后抽提重组质粒，测定其拷贝浓度，10倍梯度稀释成标准品模板10^8～10^4 copy／mm^3，进行荧光定量PCR分析．结果显示，循环阈值（Ct）与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系． 相似文献
16.
为筛选与草鱼呼肠孤病毒GCRV096 VP6发生相互作用的宿主蛋白,先将VP6基因的PCR扩增产物,克隆至酵母表达载体p GBKT7以构建其诱饵质粒(p GBKT7-VP6);再将酵母菌Y2HGold(含p GBKT7-VP6)与酵母菌Y187[含草鱼肾脏细胞(CIK)c DNA文库质粒]进行人工诱导融合,然后经选择培养筛选阳性克隆。结果共筛选到4株阳性克隆,经测序、生物信息学分析,分别属于两条不同的核苷酸序列,其中之一所编码的产物与GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)同源性较高。可见,该酶极可能在GCRV096侵染宿主的初期发挥着重要作用。 相似文献
18.
WANG Wei YOU Feng XU Jianhe SUN Wei ZHU Xiangping GAO Tianxiang ZHANG Peijun 《海洋学报(英文版)》2008,27(2):149-156
Twenty microsatellite markers （ Pol, Po13, Po33, Po35, Po42, Po48, Po56, Po89, Po91, kop6, kop7, kop8, kop12, kop15, kop18, kop21, kop22, kop23, kop26, Po-str1 ） were used to assess the meiogynogenetic and mitogynogenetic stocks of the lefteyed flounder, Paralichthys olivaceus, which were derived from single pair crossing. Twelve of the 20 loci utilized showed heterozygosity in the female and were mapped in relation to their centromeres in the meiogynogenetic diploid flounder. Microsatellitecentromere map distance, calculated under the assumption of complete interference, ranged from 15. 8 cM for kop22 to 50 cM for Po13, Po56 and Po89. Excluding the kop22, the heterozygosities of the rest of the loci were close to 100% , suggesting the occurrence of near complete interference on the chromosome arms that carried these loci. In the mitogynogenetic diploid flounder, each individual showed exact homozygousity and the segregation profiles did not deviate from the Mendelian 1：1 pattern. The results indicated that there was no lethal gene linked with the loci analyzed. Such high interference accounted for the high recombination rates and large map distances. The Po13 and Po56 loci, Po91 and kopl8 loci, kopl5 and kop21 loci are tightly linked on the same chromosome arm in pairs. 相似文献
19.
芳香化酶Cyp19a在鱼类性别决定和性别分化中起关键作用,通过调控体内雌、雄激素的转化来影响鱼类性别表型形成。为深入研究Cyp19a在牙鲆(Paralichthys olivaceus)性腺分化和发育过程中的表达规律及作用机制,本文从牙鲆cDNA中克隆获得1557bp的cyp19a基因编码序列,并成功构建了原核重组表达质粒。经体外重组与纯化获得较高纯度的重组Cyp19a蛋白;以此作为抗原免疫兔子,制备多克隆抗体。用间接酶联免疫吸附剂测定(ELISA)技术检测抗血清效价,评估其免疫原性。结果表明免疫结束后得到的抗体血清效价超过了1∶50000,且纯化后抗体具有较好活性。Western Blot(WB)检测结果表明Cyp19a兔多抗可以特异性识别牙鲆重组Cyp19a蛋白和内源性Cyp19a蛋白。蛋白水平的雌雄性腺差异表达分析显示,牙鲆Cyp19a蛋白在卵巢中高表达,在精巢中微量表达。利用Foxl2和Dmrt1重组蛋白处理牙鲆性腺分化期幼鱼可分别显著上调和下调Cyp19a的表达(P<0.05)。综上所述,本研究成功制备了牙鲆Cyp19a多克隆抗体并进行了应用,为深入研究牙鲆等鱼类性别分化机制提供有力工具。 相似文献